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摘要体外诊断通过对体液和组织等样本中的目标物进行体外检测，从而获得临床检验所需的指标和信息，其对于指导临床形成正确的治疗方案具有重要意义。病原微生物感染和肿瘤药敏是体外诊断的重点关注对象，但目前体外诊断领域缺乏在单细胞水平进行病原微生物诊断和抗癌药物药效评估的定性和定量检测方法，无法有效提高诊断的时效性与准确性。单细胞拉曼光谱技术是利用共聚焦显微拉曼光谱仪对单细胞的拉曼散射光谱进行采集和分析的技术手段，能够定量和定性的反映细胞的大量表型特征，例如其化学指纹和代谢活性。由于单细胞的自发拉曼信号极弱，对单细胞拉曼光谱采集设备的设计与性能提出极大的挑战。病原真菌和病原细菌的单细胞自发拉曼特征，以及敏感或耐药的细菌和肿瘤在药物作用下的拉曼代谢活性差异尚无较为系统深入的研究。上述问题严重限制了单细胞拉曼光谱技术在体外诊断中的应用。<br>　　本文通过设计和研制高空间分辨率和光谱分辨率的单细胞拉曼光谱仪器原理样机、建立单细胞拉曼光谱海量数据分析算法、识别真菌和细菌的单细胞拉曼光谱特征，表征细菌和肿瘤单细胞在药物作用下的单细胞代谢活性差异，形成了一套可用于体外诊断的拉曼光谱分析方法。主要研究成果包括:<br>　　根据单细胞拉曼光谱采集的实际需求，突破C-T型光谱仪的性能局限，研制了透射式拉曼光谱仪原理样机。其横向空间分辨率优于300nm，光谱分辨率最高可达0.4cm-1、光谱重复性优于0.1cm-1、单晶硅的三阶硅峰的信噪比达29∶1，可以对微生物和肿瘤单细胞进行稳定高效的拉曼光谱采集。<br>　　建立了拉曼光谱标志物的二维层次聚类分析(HCA)分析方法，并对所采集的12种临床常见的真菌与细菌的单细胞拉曼光谱进行分析，首次识别了三组用于区分真菌与细菌的拉曼光谱标志物，并以此建立了用于酵母菌感染判别的“两步鉴别”法。该方法不依赖于数据库，可以直接用于未经处理的临床尿路感染标本，在1小时内定性区分细菌感染和真菌感染。该方法的有效性在两组真实标本中得到验证，通过与拉曼单细胞弹射(RACE)和测序技术相结合，进一步确认两组未知临床样本分别为热带念珠菌和白色念珠菌。<br>　　完善了拉曼光谱结合重水标记(Raman-DIP)的单细胞代谢状态定量表征方法，优化了单细胞拉曼光谱对“代谢指数”和“代谢比率”的检测方法，建立了拉曼光谱辅助快速药敏检测技术(FRAST)。FRAST被用于评价6种质控菌株对38种抗生素的抗生素敏感性检测，其结果与传统微量肉汤稀释法一致性为88.0％，我们进一步对单细胞药敏与种群药敏的不一致的机制进行了解析。FRAST方法将尿液与血液细菌感染的药敏检测时间分别缩短至3和21小时。<br>　　探究了Raman-DIP技术对肿瘤细胞的适用性检测，确定了30％重水浓度与24小时标记时间的肿瘤细胞标记最佳条件。采用Raman-DIP评价8种不同抗癌药物处理后的两种瘤细胞系的单细胞代谢活性，建立适合单细胞水平药效评估的标准——IC30，IC30标准与金标准IC50药效检测结果完全一致。此外，本研究开展了肿瘤单细胞对抗癌药物异质性耐药的研究工作。<br>　　本文的研究成果对于优化单细胞拉曼光谱仪器研制，并为单细胞拉曼光谱技术真正用于临床提供了有力的理论与数据支持，展示了单细胞拉曼光谱技术在体外诊断定性和定量检测中的巨大潜力。