检索历史 清除

摘要糖尿病是全世界普遍存在的复杂代谢疾病之一，它与高血糖或高血糖状态有关，主要因胰岛素抵抗或/和胰岛素分泌不足导致。2021年全世界20-79岁的成年人中有5.37亿（10.5％）糖尿病患者，相当于每10个人中就有1个糖尿病患者，预计到2030年这一数字将增加到6.43亿人。2021年中国20-79岁的成年人中有1.40亿糖尿病患者，占全世界糖尿病患者的26.1％，预计到2030年这一数字将增加到1.64亿人。目前2型糖尿病治疗方式主要以降血糖药物为主，辅以饮食调控和加强运动，而降血糖药物包括口服药及皮下注射药，其中长期皮下注射药物不仅需要患者极高的依从性，也给患者带来皮肤损伤、感染等风险。<br>　　乳酸菌（lacticacidbacteria，LAB）是一类细菌的统称，它们能分解碳水化合物并产生大量乳酸。由于在人类营养中的长期安全使用，它们已被美国食品和药物管理局认可为安全的菌株，并且通常用作食品工业中的发酵剂。LAB的特定菌株被用作人类和动物健康的益生菌，因为它们可以通过产生生物活性代谢物、调节黏膜免疫和肠道通透性，在维持胃肠道稳态和影响其他器官方面发挥着至关重要的作用。<br>　　胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是一种短效的肠促胰岛素，主要由近端小肠肠内分泌L细胞合成和分泌。GLP-1的成熟形式由30个氨基酸组成，GLP-1对β细胞恢复和增殖具有多效治疗作用。然而，短暂的血浆半衰期（在循环系统中约2min）限制了其药物治疗研究和临床应用。因此，可以探索设计一种含有人长效GLP-1类似物（LGLP）的重组乳酸乳球菌，作为黏膜递送的潜在载体，通过重组乳酸菌合成分泌LGLP的生物活性分子。本文研究内容及结果如下:<br>　　（1）重组长效GLP-1类似物乳酸球菌的构建:通过分子克隆方法构建携带LGLP基因的质粒pLN-LGLP，采用电穿孔法将目的质粒导入感受态乳酸菌。结果表明成功获得了重组LGLP乳酸菌（L-pLN-LGLP），并且能表达LGLP蛋白，在有nisin诱导剂作用下其表达量明显增加。<br>　　（2）重组长效GLP-1类似物乳酸菌体内外活力研究:使用酶标仪检测OD值、平板计数法、体外模拟胃肠液培养及小动物活体成像探讨重组LGLP乳酸菌体内外的活力及重组质粒的遗传稳定性。结果表明LGLP基因能在重组乳酸菌中稳定遗传，重组LGLP乳酸菌能够通过极端的胃肠液环境，最终在小鼠肠道中定植，72h后肠道内仍有活性菌。<br>　　（3）重组长效GLP-1类似物乳酸菌体内安全性分析:通过急性（14天）、亚急性（28天）口服毒性试验，以评估重组菌的安全性和可能的发病机制。结果表明重组LGLP乳酸菌短期口服不会对宿主健康造成明显不利影响。<br>　　（4）LGLP在小鼠体内的药代动力学研究:采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，用于测定腹腔给药后小鼠血浆中GLP-1及LGLP的水平。根据拟合结果，LGLP在小鼠体内吸收较快，给药3min后血药浓度达到最高，半衰期约为20min。<br>　　（5）重组长效GLP-1类似物乳酸菌体内、体外作用研究:从体外、体内实验进一步验证LGLP是否具备GLP-1的功能，灌胃重组LGLP乳酸菌是否能达到LGLP给药的效果。结果表明重组LGLP乳酸菌可以定植在小鼠肠道中，且能短期内持续存在，重组菌分泌的LGLP能发挥GLP-1的相关作用。<br>　　综上所述，本研究成功构建表达LGLP蛋白的重组乳酸乳球菌，并验证了LGLP半衰期较GLP-1延长，且稳定性较好。重组LGLP乳酸菌表达的LGLP蛋白可通过调控胰岛素分泌、促进胰岛细胞增殖、减低体重等来调控血糖。