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摘要阿尔茨海默症(Alzheimer''sdisease，AD)是发病率最高的一种神经退行性疾病，也是老年人的主要致死原因之一。患者数随人口老龄化的加剧而激增，对社会经济和家庭造成极大的负担。但目前尚缺乏有效的干预手段来控制疾病的发展。遗传学研究发现了40多种AD风险基因和大量的AD遗传风险位点，但多数功能并不明确，深入理解这些风险基因在AD发生中的作用机制将为开发有效的干预手段提供重要线索。过往的研究中，线虫、斑马鱼、啮齿类动物、灵长类动物等经典的实验模型为AD病理研究和药物开发提供了宝贵的资料，但由于这些模型本身与人类遗传背景存在的差异，我们仍难通过现有的动物模型清楚了解在AD患者脑内发生的病理变化以及相关的分子和细胞事件。因此，迫切需要建立能够快速验证功能性AD风险位点的高效建模方法和更好模拟AD病理变化的人源化模型。<br>　　人源诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcell，iPSC)已成为研究人类疾病的重要平台。尽管已有研究运用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建携带风险突变的iPSC用于AD发病机制研究，但现有方法仍面临耗时长、阳性克隆筛选效率低、潜在脱靶效应等限制。我们针对这些方面系统性的优化了iPSC基因编辑、筛选和质控流程。我们利用核转染介导的质粒递送方法进行iPSC的基因编辑，仅在2周内就得到编辑过的iPSC细胞系，显著缩短了疾病建模时间，且瞬时转染也有效避免了长期过表达Cas9酶引起的副作用，降低了脱靶风险。同时我们也证明利用CRISPR/Cas9基因编辑没有影响iPSC的全能性和分化能力。<br>　　我们以目前作用机制尚不明确的AD风险基因ABCA7为例，通过改进基因编辑技术在iPSC疾病建模上的应用，高效构建了显著增加AD患病风险的ABCA7功能缺失的iPSC疾病模型，用于探讨ABCA7在AD病变中的作用机制。我们首先构建了ABCA7敲除的CRISPR/Cas9质粒，通过瞬时转染、抗性筛选和seed-by-seq策略进行高效筛选，仅在2周内就得到了ABCA7发生基因编辑的iPSC克隆。然后通过Westernblot证实ABCA7蛋白水平在发生基因编辑后的iPSC中显著降低。再以同一来源的健康iPSC细胞为对照，将两组细胞通过Ngn2病毒介导的方法诱导分化成神经元，发现ABCA7功能缺失后可以引起与临床相似的AD病理表型，如Aβ42及Aβ42/40水平升高。此外我们还通过高通量转录组测序(RNA-seq)和定量PCR(qPCR)分析验证了ABCA7功能缺失诱导神经元的下游差异表达基因，发现钙黏附蛋白家族基因和脂质代谢相关基因表达显著变化，为ABCA7在AD病变中的作用机制提供了新的线索。<br>　　综上所述，我们建立了能够快速筛选功能性AD风险位点的建模方法和可以有效模拟AD病理变化的人源iPSC疾病模型，有助于AD风险基因的病理机制研究和药物精准干预。