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摘要第一部分大鼠脑出血后脑组织中MIC60蛋白表达水平变化的研究<br>　　目的:1探讨MIC60在大鼠脑出血后在脑组织中的蛋白表达水平。2探究MIC60在脑组织细胞中的表达定位。3观察脑出血后线粒体是否受损。<br>　　方法:<br>　　1.随机选取42只成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠（250g-350g，8-12周）分成7组，随机平均分为为假手术组(Sham)和ICH后3小时组、ICH后6小时组、ICH后12小时组、ICH后24小时组、ICH后48小时组和ICH后72小时组等7个实验组。Sham组大鼠模型的建立方法:4％水合氯醛溶液(1ml/100g)麻醉大鼠后，向右侧基底节区用微量注射器以20μl/min的速度缓慢注入无菌生理盐水100μl;建立ICH组大鼠模型的方法:4％水合氯醛溶液(1ml/100g)麻醉大鼠后，用微量注射器从大鼠股动脉取得自体动脉血150μl，手术时向右侧基底节区用微量注射器以20μl/min的速度缓慢注入自体动脉血100μl。在麻醉或者造模过程中若出现大鼠死亡则在同一批购买的大鼠中选取相应数量大鼠进行相同处理以补充各组大鼠样本数。<br>　　2.造模后3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时通过脱颈处死大鼠，取得出血侧大脑半球组织，研磨提取蛋白后进行Westernblot实验，检测假手术组(Sham)和ICH后3h组、ICH后6h组、ICH后12h组、ICH后24h组、ICH后48h组和ICH后72h组的MIC60蛋白表达水平的变化情况;在Sham组和ICH后各时间点取ICH进针点后4mm脑组织制作石蜡切片，进行免疫荧光实验观察神经元中MIC60的蛋白表达情况;使用电镜观察Sham组和脑出血后线粒体的形态和受损情况。<br>　　结果:<br>　　1、Westernblot实验结果显示:大鼠脑组织中的MIC60蛋白表达水平在ICH后的3h-12h内会出现一定程度的波动，但与Sham组相比，变化的程度较小，均未出现统计学意义上的水平改变差异，ICH后24h后MIC60蛋白表达水平出现急剧下降，表达量不足Sham组MIC60蛋白表达水平的一半，ICH后48h以及ICH后72hMIC60的蛋白表达水平又逐渐上升。<br>　　2、免疫荧光共染的结果显示:MIC60主要表达于大鼠脑组织神经元中。<br>　　3、电子显微镜下观察Sham组与ICH后24h组大鼠神经元中线粒体的形态，我们发现与假手术组相比，ICH后大鼠神经元中线粒体受损，线粒体肿胀变形，嵴连接断裂。<br>　　结论:<br>　　1、ICH后，大鼠脑组织中MIC60蛋白表达水平在ICH发生后24h时最低;<br>　　2、MIC60主要表达于神经元中;<br>　　3、ICH后大鼠神经元中存在线粒体损伤。<br>　　第二部分调控MIC60表达对ICH后大鼠脑组织中细胞死亡以及大鼠行为学的影响<br>　　目的:通过调控MIC60的蛋白表达水平变化后，对下游蛋白Pink1和Parkin蛋白表达的影响，观察大鼠ICH后脑组织中细胞死亡情况的变化以及动物行为学水平的变化。<br>　　方法:<br>　　1、随机选取72只大鼠平均分为6个实验组，假手术组(Sham)、脑出血后24h组（ICH组）、MIC60小干扰RNA对照组（SiRNAnegativecontrol，Si-NC）、MIC60小干扰RNA组(Si-MIC60，Si-RNA)、空载组(Vector)以及MIC60过表达组(Over-expressionMIC60，Over-MIC60)，每组12只大鼠。Sham组以及ICH组大鼠建立模型时按照第一部分造模方法:麻醉大鼠后向右侧基底节区用微量注射器以20μl/min的速度缓慢注入无菌生理盐水或者自体动脉血100μl。MIC60小干扰RNA对照组(Si-NC)、MIC60小干扰RNA组(Si-RNA)、空载组(Vector)以及MIC60过表达组(Over-MIC60)这四组中的大鼠分别向各只大鼠的侧脑室中注射小干扰RNA及其对照试剂、过表达质粒及其对照试剂，相关试剂注射完毕48小时后，通过腹腔注射4％水合氯醛溶液(1ml/100g)麻醉大鼠后，用微量注射器从大鼠股动脉取得自体动脉血150μl，手术时向右侧基底节区用微量注射器以20μl/min的速度缓慢注入自体动脉血100μl,建立大鼠ICH模型。麻醉、侧脑室注射干预试剂或者ICH造模过程中若出现大鼠死亡，则在同一批购买的大鼠中选取相应数量大鼠进行相同处理补充各组大鼠样本数。<br>　　2、6组大鼠中每组随机选取6只在脑出血模型建立24小时后后通过脱颈处死大鼠，取得出血侧大脑半球组织，研磨提取蛋白后进行Westernblot实验，检验小干扰RNA和过表达质粒转染后MIC60的蛋白表达水平变化情况，检测MIC60蛋白水平变化后Pink1和Parkin的蛋白表达水平变化。取进针点后4mm脑组织用福尔马林固定，制作石蜡切片，分别进行FJB染色和TUNE染色，用荧光显微镜观察MIC60蛋白表达水平变化后脑组织中细胞死亡情况。<br>　　3、用各组中剩余的6只大鼠进行神经功能学评分、转棒实验、贴纸实验、水迷宫实验，检测MIC60蛋白表达水平变化后对大鼠行为学水平的影响。<br>　　结果:<br>　　1、Westernblot结果显示，与Sham组相比，ICH组大鼠脑组织中MIC60的蛋白表达水平的变化降低，结果与第一部分一致;与Si-NC组相比，当侧脑室注射MIC60的小干扰RNA后，MIC60的蛋白表达水平下降;当侧脑室注射MIC60的过表达质粒后，MIC60的蛋白表达水平上升，而ICH组、Si-NC组、Vector组大鼠脑组织中MIC60的蛋白表达水平大致相同，在统计上无明显差异。<br>　　2、ICH24h后，Pink1蛋白表达水平明显减少。当MIC60蛋白表达水平升高时Pink1蛋白表达水平也同样升高，当MIC60蛋白表达水平降低时Pink1蛋白表达水平降低。而MIC60蛋白表达水平变化时，不同组之间的Parkin蛋白表达水平没有显著差异。<br>　　3、FJB染色和TUNEL染色结果显示，与Sham组相比，ICH组大鼠脑组织中神经细胞死亡数量明显升高;当侧脑室注射MIC60的小干扰RNA后，MIC60的蛋白表达水平下降，而死亡细胞的数量则增高;当侧脑室注射MIC60的过表达质粒后，MIC60的蛋白表达水平上升，死亡细胞的数量下降;ICH组、Si-NC组、Vector组大鼠脑组织中细胞死亡的数量大致相同，在统计上无明显差异。<br>　　4、ICH后大鼠自发性活动、本体感觉、触摸鼻毛、肢体对称性、侧转、前肢伸展、攀爬等行为功能受损，Over-MIC60组大鼠的行为表现要比Vector组大鼠更好。<br>　　5、与Sham组大鼠相比，ICH后大鼠的运动、感觉、学习及记忆能力受损，当MIC60蛋白表达水平增高时，大鼠的运动、感觉、学习及记忆能力的恢复速度要快于对照组大鼠。<br>　　结论:<br>　　1、MIC60小干扰RNA转染脑组织后会使MIC60的蛋白表达水平下降，MIC60过表达质粒转染脑组织后会使MIC60的蛋白表达水平上升;<br>　　2、Pink1蛋白表达水平随着MIC60的表达变化而变化，而Parkin蛋白表达水平不随着MIC60的表达变化而发生改变;<br>　　2、过表达MIC60会抑制由于ICH造成的神经细胞死亡，保护脑组织;<br>　　3、过表达MIC60组大鼠在自发性活动、本体感觉、触摸鼻毛、肢体对称性、侧转、前肢伸展、攀爬等七个方面的表现要优于对照组大鼠;<br>　　4、过表达MIC60组大鼠在运动能力、肢体感觉、空间学习等方面的恢复速度要快于对照组大鼠。<br>　　第三部分MIC60在ICH后发挥脑保护作用的潜在机制研究<br>　　目的:通过氧合血红蛋白(OxyHb)在体外培养原代神经元模拟ICH模型，探讨MIC60发挥脑保护作用的途径以及相关信号分子。<br>　　方法:<br>　　1、从孕12-18天的孕鼠的皮质组织中分离原代神经元培养，首先收集孕鼠的大脑半球（无脑膜和血管）。然后用0.25％胰蛋白酶(Gibco，GrandIsland，NY,USA)在37℃下消化5分钟，PBS洗涤3次。1000转/分钟离心5分钟，重悬于完整培养基（含0.5mM谷氨酰胺TM-I、2％B27、50U/mL链霉素、50U/mL青霉素的神经基础培养基;所有从Gibco)。最后，将分离的细胞接种于预先涂有0.1mg/mL聚d-赖氨酸(Gibco)的六孔板中，密度为30，000个细胞/crm2。把需要接种的细胞，经过在培养基中培养，温度设定在37℃、5％CO2。每隔2d，用新鲜的完全培养基交换一半的完全培养基。分离后7～10d，将这些培养的神经元在37℃下用5uMOxyHb处理24h，以模拟ICH体外。<br>　　2、将培养后的神经元分为对照组、氧化血红蛋白刺激后3h组、氧化血红蛋白刺激后6h组、氧化血红蛋白刺激后12h组、氧化血红蛋白刺激后24h组、氧化血红蛋白刺激后48h组、氧化血红蛋白刺激后72h组等7组，用westernblot实验检测MIC60蛋白表达水平，选择进行干预的时间点。<br>　　3、将培养后的神经元分为对照组(Control)、OxyHb组、OxyHb+Si-NC组、OxyHb+Si-MIC60组(OxyHb+Si-RNA)、OxyHb+Vector组(Vector)、OxyHb+Over-expressionMIC60组(OxyHb+Over-MIC60)，并注射相关干扰试剂及其对照组试剂，然后用westernblot实验检测各组MIC60的蛋白表达水平;进行活死细胞染色、Annexin-Ⅴ染色、PI染色以及JC-1染色;<br>　　5、将培养后的神经元分为对照组（Control）、OxyHb组、OxyHb+Si-NC组、OxyHb+Si-MIC60组(OxyHb+Si-RNA)、OxyHb+Vector组(Vector)、OxyHb+Over-expressionMIC60组(OxyHb+Over-MIC60)，并注射相关干扰试剂及其对照组试剂。通过westernblot实验检测MIC60小干扰RNA和MIC60过表达质粒转染后体外培养的原代神经元中Pink1的蛋白表达水平变化情况，而后使用CCCP诱导神经元线粒体自噬，观察MIC60蛋白表达变化后各组神经元线粒体自噬的情况。<br>　　结果:<br>　　1、体外培养神经元在氧化血红蛋白刺激12h后MIC60的蛋白表达水平最低，体外培养神经元Si-RNA转染后MIC60的蛋白表达水平下降;过表达质粒转染后，体外培养神经元表达MIC60蛋白水平升高;<br>　　2、通过活死细胞染色，Annexin-Ⅴ染色和PI染色我们发现当MIC60蛋白表达水平升高时，凋亡细胞的数量减少，当Si-RNA转染使MIC60蛋白表达水平下降时，凋亡神经细胞的数量增多;<br>　　3、JC-1染色结果表明:与对照组相比，OxyHb组红色荧光强度降低，绿色荧光强度增加，提示MMP降低，线粒体-通透性过渡孔打开，说明OxyHb刺激后，体外培养的原代神经元线粒体受损。与OxyHb+Vector组，OxyHb+Over-MIC60组红色荧光强度升高，绿色荧光强度减弱;相反，在OxyHb+siRNA组中，红色荧光强度减弱，绿色荧光强度增强。说明过表达MIC60可通过减少OxyHb处理后导致的线粒体损伤和诱导线粒体自噬，对原代培养神经元产生保护作用。<br>　　4、Mt-Keima质粒含有线粒体定位序列，正常生理状态下该质粒的激发光为458nm。而当线粒体发生自噬时，位于溶酶体包膜线粒体上的质粒的激发光由458nm变为543nm。因此，这两种激发光的荧光比值反映了细胞内线粒体自噬的水平。CCCP处理后，荧光染色结果显示:与对照组相比，OxyHb+Vector组的红色荧光强度减弱，而Over-MIC60组的红色荧光强度升高，对比说明MIC60促进了线粒体自噬。<br>　　5、CCCP处理后，在对照组中，Parkin被招募到线粒体中，诱导线粒体自噬，从而清除受损的线粒体。与对照组相比，OxyHb刺激组的Parkin招募受到抑制，而MIC60过表达后Parkin的招募得到逐渐恢复。<br>　　结论:OxyHb刺激后线粒体自噬被抑制，而过表达MIC60有助于线粒体自噬，这种现象与Parkin招募到受损线粒体有关。