检索历史 清除

摘要研究背景<br>　　胃癌死亡率在全球肿瘤中位居第四位。分子靶向药物曲妥珠单抗可显著延长晚期胃癌(HER2阳性)患者生存期。内质网应激(Endothelialreticulumstress，ERS)与肿瘤耐药密切有关。微小RNA是ERS信号调节通路中重要的内源性基因调节因子。我们团队先前研究已经证实，内质网应激状态下胃癌细胞通过诱导miR-301a-3p的表达调控胃癌对曲妥珠单抗产生耐药，但具体分子机制尚不清楚。本课题拟重点探讨，ERS诱导的miR-301a-3p调控胃癌曲妥珠单抗耐药的具体机制。<br>　　内容和方法<br>　　1.通过靶基因预测软件TargetScanHuman7.1和miRDB软件系统进行在线靶基因预测分析。<br>　　2.双荧光素酶报告基因检测验证靶基因LRIG1。<br>　　3.应用荧光定量PCR(Quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qRT-PCR)和WesternBlot检测不同状态胃癌细胞在曲妥珠单抗作用下的LRIG1表达水平。<br>　　4.ERS状态在NCI-N87或MKN45细胞中分别过表达或抑制miR-301a-3p，使用WesternBlot检测LRIG1、GRP78、p-AKT/AKT、p-ERK，以及ERK蛋白表达。<br>　　5.在NCI-N87或MKN45细胞中，分别使用WesternBlot检测过表达及抑制miR-301a-3p在TG和曲妥珠单抗干预下LRIG1、GRP78、p-AKT、AKT、p-ERK，以及ERK蛋白表达水平。<br>　　6.使用人酪氨酸激酶磷酸受体阵列在NCI-N87细胞中检测ERS状态下表达改变的酪氨酸激酶磷酸化受体。<br>　　7.使用WesternBlot检测ERS状态NCI-N87或MKN45细胞的IGF-1R和FGFR1表达水平。<br>　　8.qRT-PCR检测经miR-301a-3p/RNAi与siLRIG1共转染后，ERS状态NCI-N87或MKN45细胞的IGF-1R和FGFR1mRNA水平。<br>　　9.WersternBlot检测经miR-301a-3p/RNAi与siLRIG1共转染后，ERS状态NCI-N87或MKN45细胞的LRIG1、GRP78、IGF-1R、FGFR1、p-AKT、AKT、p-ERK以及ERK等蛋白表达。<br>　　10.WesternBlot检测经miR-301a-3p/RNAi与siLRIG1共转染后，ERS状态MKN45或NCI-N87细胞在曲妥珠单抗作用下的LRIG1、GRP78、p-AKT/AKT、p-ERK以及ERK蛋白表达。<br>　　结果<br>　　1.在线靶基因预测分析提示，LRIG1基因3''-UTR序列与miR-301a-3p存在结合位点。<br>　　2.双荧光素酶报告基因检测支持靶基因LRIG1，提示miR-301a-3p可以直接作用于LRIG1的3''-UTR，miR-301a-3p对LRIG1具有调控作用。<br>　　3.在曲妥珠单抗的作用下，MKN45或NCI-N87细胞的LRIG1表达明显上调，而ERS状态MKN45或NCI-N87细胞的LRIG1蛋白表达明显下调。<br>　　4.抑制miR-301a-3p表达后，ERS状态MKN45或NCI-N87细胞的LRIG1蛋白表达明显上调，p-ERK和p-AKT蛋白表达明显下调。<br>　　5.抑制miR-301a-3p表达后，ERS状态MKN45或NCI-N87细胞在曲妥珠单抗的作用下，LRIG1蛋白表达明显上调，p-ERK和p-AKT蛋白表达明显下调。<br>　　6.ERS状态NCI-N87或MKN45细胞的IGF-1R和FGFR1表达显著升高。<br>　　7.miR-301a-3p/RNAi与siLRIG1共转染，ERS状态MKN45或NCI-N87细胞中，p-AKT和p-ERK蛋白表达显著上调，IGF-1R和FGFR1的蛋白表达水平显著上调。<br>　　8.miR-301a-3p/RNAi与siLRIG1共转染，ERS状态MKN45或NCI-N87细胞在曲妥珠单抗作用下，p-AKT和p-ERK蛋白表达显著上调，IGF-1R和FGFR1蛋白表达显著上调。<br>　　结论<br>　　1.内质网应激诱导的miR-301a-3p通过下调LRIG1的表达，激活AKT以及ERK通路，从而介导胃癌细胞对曲妥珠单抗的耐药。<br>　　2.内质网应激诱导的miR-301a-3p通过下调LRIG1的表达，上调IGF-1R以及FGFR1的表达，从而介导胃癌细胞对曲妥珠单抗的耐药。