检索历史 清除

摘要研究背景及目的<br>　　心肌缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusioninjury，IRI）时，缺血区、交界区和远隔区的心肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞及中性粒细胞等都可能起到不同的作用。饥饿状态下心肌细胞的自噬现象是“弱肉强食”，即健康的细胞吞噬不健康的细胞。细胞之间可通过旁分泌和外泌体(Exosome，EXO)等媒介进行对话，那么非缺血的心肌纤维细胞释放的外泌体会对缺血的心肌细胞产生什么影响？在心肌IRI中，正常成纤维细胞外泌体是减轻还是加重损害，目前知之甚少。<br>　　心肌损伤时，成纤维细胞被激活并高度增殖，成为支撑心室壁的关键组分。文献报道病理情况下心肌成纤维细胞可通过旁分泌方式保护或加剧心肌受损。新生大鼠正常心肌成纤维来源的外泌体的测序结果分析发现与细胞存活相关的microRNA（miRNA）中多数有促细胞凋亡的作用，因此，我们假设在心肌IRI中成纤维细胞外泌体通过释放促心肌细胞凋亡的miRNA而加重心肌损伤。<br>　　研究内容和方法<br>　　本研究选取出生1-2天的SD大鼠乳鼠心肌成纤维细胞进行培养，收集足量上清液进行差速离心。免疫印迹实验(Westernblot)检测外泌体的标记蛋白CD81、CD63、TSG101，透射电镜和纳米粒子追踪分析系统鉴定形态、颗粒大小及直径。使用PKH67染料特异性标记外泌体，将外泌体分别加入至常氧和缺氧的新生大鼠心肌细胞，进行免疫荧光染色观察外泌体是否被心肌细胞摄取。使用TUNEL染色进行凋亡心肌细胞数的观察比较。荧光实时定量PCR(qPCR)和Westernblot检测相关凋亡基因和蛋白Caspase3、Bax和Bcl2。使用GEO数据库中的大鼠乳鼠心肌成纤维细胞外泌体的miRNA测序数据(GSE76175)进行生物信息学分析。选取在外泌体内表达量最高的前20条miRNA并使用Targetscan、DIANATOOLS、Metascape等数据库网站进行靶基因及通路分析。<br>　　研究结果<br>　　我们从大鼠乳鼠心肌成纤维细胞中提取了外泌体并进行鉴定。将乳鼠心肌细胞与外泌体共培养，发现在缺氧复氧情况下，心肌细胞Cltc蛋白表达上调，外泌体摄取增加。TUNEL染色发现缺氧复氧+外泌体组(A/R+EXO)的心肌细胞凋亡阳性率明显高于对照组(14.65％vs10.86％，P＜0.05)。qPCR和Westernblot实验结果均显示A/R+EXO组促凋亡蛋白Caspase3明显增加。通过分析测序数据发现与凋亡信号通路相关的miRNA有12个，其中富集的6个均促进心肌细胞凋亡，在这6个miRNA中有5个具有共同靶向基因Rap1b，它们分别是rno-miR-9a-5p、rno-miR-92b-3p、rno-miR-181a-5p、rno-miR-494-3p和rno-miR-708-5p。<br>　　结论<br>　　常氧心肌成纤维细胞外泌体通过释放系列microRNA下调心肌细胞Rap1b蛋白促进缺氧复氧后心肌细胞凋亡。