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摘要背景与目的:心力衰竭（心衰）是心脏疾病的严重或终末阶段。尽管肾素-血管紧张素系统抑制剂、β受体拮抗剂、醛固酮受体拮抗剂、钠-葡萄糖协同转运蛋白抑制剂等已成为射血分数减低心衰治疗的基石，心衰的死亡率和再住院率仍然很高，带来巨大经济负担。因此，探索新的心衰治疗靶点尤为重要。大量研究表明炎症反应是心力衰竭病理生理的重要机制，炎症标志物的水平与疾病的预后和严重程度相关。<br>　　线粒体功能障碍与心力衰竭的发展有关。线粒体中的氧化代谢是心脏的主要能量来源，长期以来，人们一直认为线粒体功能障碍引起收缩功能障碍的主要机制是线粒体无法产生和传递能量。然而，线粒体在心脏中的作用不局限于此，还包括氧化还原失衡、蛋白质修饰、ROS生成、受损线粒体Ca2+稳态和炎症等。<br>　　近来，线粒体介导的炎症反应得到广泛重视。在应激条件下，线粒体可释放内源性因子，即损伤相关分子模式（DAMPs），被模式识别受体(PRRs)识别后启动下游的信号通路，从而引起炎症反应。因此，线粒体介导的炎症反应有可能在心力衰竭的发生发展起重要作用，值得我们去探索。<br>　　研究表明cGAS-STING信号通路异常激活可引起Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)及相关炎性基因的过度表达。在帕金森疾病、肾脏病中，线粒体损伤mtDNA异常累积泄露到胞质中可导致炎症反应，而敲除STING可阻断cGAS-STING信号通路，减轻炎症反应，抑制靶器官损害。<br>　　如何清除心力衰竭病程中心肌细胞线粒体受损后释放的内源性因子，进而抑制cGAS-STING途径参与固有免疫，从而减轻心肌组织的的炎症反应，是值得探索课题。线粒体自噬通过细胞自噬来清除细胞内损伤或者功能异常的线粒体。PINK1在心脏损伤期间介导线粒体自噬参与线粒体质量控制。PINK1是一种线粒体膜蛋白，PINK1主要在神经元退行性疾病中起着重要作用。越来越多的证据表明PINK1有着心脏保护作用。研究发现PINK1敲除的小鼠诱导心肌氧化应激水平增高，线粒体功能障碍，小鼠心肌肥厚。而增加PINK1介导的心肌细胞线粒体自噬水平，可以增强线粒体功能，减少ROS产生，减少细胞凋亡，阻止TAC小鼠慢性心衰的发生。<br>　　因此我们假设，通过调控PINK1，增加线粒体自噬水平，清除损伤的线粒体，维护线粒体功能及结构的稳定，减少DAMPs释放，可以阻断cGAS-STING炎症通路激活，抑制炎症反应，进而阻断炎症对心肌带来的不利影响。本研究中，我们分别通过在野生型(WT)小鼠、PINK1过表达(PINK1-Tg)、PINK1敲除(PINK1-KO)、PINK1和STING双基因敲除(double-knockout,DKO)的转基因小鼠中构建压力负荷诱导的心衰小鼠模型，来验证这一假设。<br>　　方法:对WT，PINK1-Tg、PINK1-KO、DKO的雄性小鼠（8-10周龄左右，体重20-24g），构建主动脉弓缩窄(TAC)模型或假手术（sham）。手术后8周，对小鼠进行超声心动图检查评估其心脏结构和功能;采集心脏、肺脏和胫骨等相关数据;心脏组织行HE染色、麦胚凝集素染色(WGA)和Masson染色来评估心肌肥厚程度和心肌纤维化程度;炎症指标通过免疫组化和PCR、心脏血清细胞因子通过MILLIPLEX小鼠细胞因子/趋化因子测定;线粒体微观结构采用透射电镜评估;线粒体自噬通过免疫荧光染色和免疫印迹(WB)评估;心肌细胞凋亡通过免疫印迹评估。实验方案如下:<br>　　1.实验一:野生型(WT)小鼠中，分别行TAC模型和假手术(sham)，探究压力负荷诱导的小鼠模型中，心脏cGAS-STING炎症通路激活、线粒体损伤、和PINK1表达情况。采用野生型(WT)小鼠，分为2组（TAC组，sham组）。<br>　　2.实验二:探究PINK1-KO对cGAS-STING炎症通路激活、线粒体损伤、线粒体自噬、凋亡、心脏结构和功能的影响。分为4组(WT+sham，WT+TAC，PINK1-KO+sham,PINK1-KO+TAC)。<br>　　3.实验三:探究PINK1-Tg对cGAS-STING炎症通路激活、线粒体损伤、线粒体自噬、凋亡、心脏结构和功能的影响。分为4组(WT+sham，WT+TAC，PINK1-Tg+sham,PINK1-Tg+TAC)。<br>　　4.实验四:探究DKO对心脏结构和功能、STING炎症通路的影响。分为3组(WT+TAC,PINK1-KO+TAC,DKO+TAC)。<br>　　结果:<br>　　1.TAC模型小鼠心脏cGAS-STING信号通路激活<br>　　8周后，与假手术(sham)组相比，TAC模型诱导的心衰小鼠心肌组织中CD45+、CD68+浸润增加，炎性细胞因子IL-6，TNF-α，IFNβ1，cxcl-10水平增高（通过qPCR检测），心脏血细胞因子IL-1β，TNF-α，MCP-1，IL-6水平升高(MILLIPLEX检测)，cGAS-STING信号通路蛋白cGAS、STING、p-TBK1、p-P65、p-IRF3表达增加（通过WB检测）。<br>　　2.TAC模型小鼠线粒体损伤，自噬降低活性降低，PINK1蛋白表达降低<br>　　TAC8周诱导心衰小鼠心肌线粒体损伤严重，结构紊乱（透射电镜观察），自噬水平降低（免疫组织荧光染色提示LC3表达阳性细胞数明显降低，而P62表达明显增高）。WB发现TAC小鼠心肌组织中PINK1蛋白的表达量明显降低。<br>　　3.敲除PINK1加重压力负荷诱导心衰小鼠的心肌肥厚、心功能不全，增强cGAS-STING信号通路激活。<br>　　对4组小鼠(WT+sham，WT+TAC，PINK1-KO+sham，PINK1-KO+TAC)进行检测。TAC8周后，与WT+TAC组相比，PINK1-KO+TAC组小鼠心肌肥厚、心功能不全加重，表现为:心重和体重比值、心重和胫骨长度比值、心肌细胞横截面积(WGA)明显增加，收缩期后壁厚度和舒张期后壁厚度(LVPWs和LVPWd)、左室的收缩末内径(LVEDs)和舒张末内径(LVEDd)更大，左室射血分数(LVEF)和左室缩短率(LVFS)显著下降，纤维化严重（HE染色），ANP表达增加(WB)。<br>　　与WT+TAC组相比，PINK1-KO+TAC组小鼠心肌组织qPCR检测细胞因子（IL-6，TNF-α，IFNβ1，cxcl-10)和心脏血清炎症因子检测(IL-1β，TNF-α，MCP-1，IL-6)都显示炎性细胞因子水平增高，WB表明cGAS-STING信号通路蛋白cGAS、STING、p-TBK1、p-P65、p-IRF3表达增加。<br>　　4.过表达PINK1减轻压力负荷诱导心衰小鼠的心肌肥厚、心功能不全，抑制cGAS-STING信号通路激活。<br>　　对4组小鼠（WT+sham，WT+TAC，PINK1-Tg+sham，PINK1-Tg+TAC）进行检测。TAC8周后，与WT+TAC组相比，PINK1-Tg+TAC组小鼠心肌肥厚减轻、心功能不全得到改善，表现为:心重和体重比值、心重和胫骨长度比值、心肌细胞横截面积(WGA)明显降低，LVPWs、LVPWd、LVEDs、LVEDd显著降低，LVEF、LVFS显著上升，纤维化减轻(HE染色)，ANP表达降低(WB)。<br>　　与WT+TAC组相比，PINK1-Tg+TAC组小鼠心肌组织qPCR检测细胞因子(IL-6，TNF-α，IFNβ1，cxcl-10)和心脏血清炎症因子检测(IL-1β，TNF-α，MCP-1，IL-6)都显示炎性细胞因子水平降低，WB表明cGAS-STING信号通路蛋白cGAS、STING、p-TBK1、p-P65、p-IRF表达降低。<br>　　5.PINK1在调节压力负荷引起的心衰小鼠心脏的线粒体损伤，线粒体自噬中的作用。<br>　　TAC8周诱导小鼠心衰，透射电镜发现鼠心衰小鼠心肌的线粒体结构紊乱;免疫荧光染色和WB提示心肌自噬水平降低（LC3表达降低，P62表达增高）。PINK1-KO加重了线粒体结构紊乱，自噬水平进一步降低，而PINK1-Tg减轻线粒体结构紊乱，提高了线粒体自噬水平，心肌凋亡降低（WB发现BAX、cleaved-Caspase3/Caspase3蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达增多）<br>　　6.PINK1通过调节STING通路来影响心肌肥厚、心功能不全、STING炎症激活。<br>　　对3组小鼠（WT+TAC，PINK1-KO+TAC，DKO+TAC）进行检测。TAC8周后，与PINK1-KO+TAC组相比，DKO+TAC组小鼠心肌肥厚、心功能不全减轻，表现为:心重和体重比值、心肌细胞横截面积(WGA)明显减少，舒张末内径(LVEDd)更小，左室射血分数(LVEF)显著升高，纤维化（HE染色，Col1和Col2的mRNA水平）减轻，ANP和BNP的mRNA水平降低。<br>　　与PINK1-KO+TAC组相比，DKO+TAC组小鼠心肌组织qPCR检测细胞因子和心脏血清炎症因子检测都显示炎性细胞因子水平降低，WB表明STING信号通路蛋白p-TBK1、p-IRF、p-P65、表达降低。<br>　　结论:<br>　　1.压力负荷诱导的心衰小鼠心肌线粒体损伤，自噬水平降低，cGAS-STING信号通路激活，PINK1蛋白表达降低。<br>　　2.PINK1-KO加重压力负荷诱导的心衰小鼠的心肌线粒体损伤，线粒体自噬水平进一步降低，cGAS-STING信号通路进一步激活，心肌肥厚和心功能不全进一步加重。<br>　　3.PINK1-Tg可以抑制压力负荷诱导的心衰小鼠心肌线粒体损伤，增加线粒体自噬水平，抑制cGAS-STING信号通路激活，减少细胞凋亡，减轻心肌肥厚和改善心功能不全。<br>　　4.PINK1通过调控线粒体自噬来清除损伤的线粒体，阻断cGAS-STING炎症通路，抑制炎症反应，减轻心功能障碍及心脏炎症反应。<br>　　5.PINK1通过调节STING通路来影响心肌肥厚、心功能不全及心脏炎症。