DRP1依赖的mtDNA释放介导枯否细胞STING信号通路激活导致脓毒症肝损伤-论文-万方医学网

DRP1依赖的mtDNA释放介导枯否细胞STING信号通路激活导致脓毒症肝损伤

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摘要脓毒症是宿主对感染的反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍。肝脏作为机体重要的代谢和免疫防御器官，在脓毒症发病过程中发挥重要的宿主防卫作用。肝脏血运丰富且解剖位置独特，其作为肠道内毒素和过度炎症反应攻击的靶点，是脓毒症最易受累的器官之一。据统计，有高达46％的脓毒症患者合并肝功能损伤，而肝功能障碍作为一个独立危险因素严重影响脓毒症患者的预后。 　　研究目的: 　　本研究将从LPS诱导的内毒素血症小鼠动物模型和LPS刺激原代枯否细胞模型两个水平，探讨脓毒症时枯否细胞STING信号通路激活与肝脏损伤之间的关系，并着重阐明线粒体分裂介导枯否细胞STING信号通路激活的具体机制。 　　研究方法: 　　第一部分:枯否细胞STING信号通路激活导致脓毒症肝损伤 　　采用腹腔注射LPS（10 mg/kg）构建小鼠脓毒症模型，免疫组化观察肝脏组织中STING蛋白的表达及分布。采用门静脉原位灌注Ⅳ型胶原酶、梯度离心及差速贴壁的方法获得原代枯否细胞和肝细胞。免疫印迹观察LPS造模后原代枯否细胞中STING蛋白表达及其下游IRF3、p65蛋白的磷酸化水平，q-PCR检测枯否细胞中IFN-β、TNF-α、IL-1的mRNA水平以证实脓毒症时枯否细胞中STING信号通路被激活。接着，在动物水平，采用STING基因突变小鼠（STINGgt，STING蛋白合成缺陷）或采用STING特异性激动剂DMXAA（缩写为DMX），LPS造模后，提取各组小鼠的肝细胞，免疫印迹检测凋亡相关蛋白cleaved caspase3的表达及程序性坏死相关蛋白MLKL蛋白的磷酸化水平改变，HE染色观察肝脏组织病理改变，检测肝功能(ALT、AST)及血清中IFN-β、TNF-α、IL-1的水平。在细胞水平，分别提取野生型小鼠和STINGgt小鼠的原代枯否细胞，给或不给予DMX (25 μg/ml)处理后，给予LPS（100 ng/ml）刺激，收取枯否细胞的条件培养基用来刺激野生型小鼠原代肝细胞后，采用AnnexinⅤ/PI染色后行流式细胞术检测细胞死亡比例，并收集肝细胞培养上清，检测上清中肝酶(ALT、AST)水平。通过以上两个水平的检测结果证实枯否细胞STING信号通路激活导致脓毒症小鼠肝损伤。 　　第二部分:线粒体分裂释放mtDNA介导枯否细胞STING信号通路激活 　　通过免疫印迹检测LPS造模后小鼠枯否细胞中DRP1蛋白表达及其S616位点的磷酸化水平。接着，提取正常小鼠的枯否细胞转染shDRP1，免疫印迹验证转染效率后给予LPS刺激(100 ng/ml)，免疫荧光观察线粒体形态及线粒体与S616p-DRP1的共定位情况。之后免疫印迹检测各组枯否细胞STING蛋白表达及其下游IRF3、p65蛋白的磷酸化水平，证实LPS诱导的枯否细胞STING信号通路激活与线粒体分裂有关。通过免疫荧光检测各组枯否细胞dsDNA的释放情况，q-PCR检测胞质中线粒体D-环(D-loop)调控区mtDNA片段的含量，以明确下调DRP1表达对mtDNA释放的影响。接着枯否细胞在转染DRP1过表达腺病毒的基础上，应用PULSin Polyplus转染系统导入DNase Ⅰ后再给予LPS刺激，通过q-PCR检测D-loop区域胞浆中的含量以及STING信号通路下游炎症因子IFN-β mRNA水平，明确LPS诱导的枯否细胞STING信号通路激活依赖于DRP1介导的线粒体分裂。免疫荧光检测转染shDRP1的枯否细胞在LPS刺激后线粒体活性氧(Mitochondrial ROS，mtROS)水平，以明确下调DRPI的表达对枯否细胞线粒体氧化应激的影响。之后应用线粒体抗氧化剂-MitoQ，在给予LPS刺激后，通过q-PCR检测D-loop区域胞浆中的含量以及STING信号通路下游炎症因子IFN-β mRNA水平，明确mtROS对mtDNA释放以及后续STING信号通路激活的影响。CCK-8法检测不同LPS刺激时间和刺激浓度对枯否细胞活力的影响，并通过蛋白交联和免疫印迹检测VDAC1的寡聚化，探索LPS刺激枯否细胞后mtDNA释放途径。在动物水平，使用DRP1 GTPases抑制剂-Mdivi-1（20 mg/ml）后给予LPS刺激，免疫印迹检测各组小鼠枯否细胞中STING蛋白表达及IRF3、p65、DRP1蛋白的磷酸化水平，ELISA检测血清中IFN-β、TNF-α、IL-1的水平，AnnexinⅤ/PI染色后行流式细胞术检测肝细胞死亡比例，HE染色观察肝脏组织病理改变，生化试剂盒检测肝功能。通过以上检测来探讨线粒体分裂介导枯否细胞炎症激活的机制以及明确抑制线粒体分裂对脓毒症肝损伤的影响。 　　研究结果: 　　第一部分:枯否细胞STING信号通路激活导致脓毒症肝损伤 　　1.LPS诱导的脓毒症小鼠肝枯否细胞STING信号通路被激活 　　STING蛋白在肝脏组织中分布具有细胞特异性，STING蛋白在枯否细胞中表达而在肝细胞中不表达。LPS诱导的脓毒症小鼠原代枯否细胞中STING蛋白的表达及其下游IRF3、p65蛋白磷酸化水平明显升高，且IFN-β、TNF-α、IL-1βmRNA水平显著上调。 　　2.STING信号通路激活促进LPS诱导的脓毒症小鼠肝脏损伤 　　STINGgt小鼠在给予LPS处理后，其肝脏损伤病理评分、肝酶ALT和AST水平、血清中炎症因子IFN-β、TNF-α、IL-1β的水平均明显下降，而给予DMX处理的小鼠在接受LPS刺激后，其肝脏损伤病理评分、肝酶ALT水平、血清中炎症因子IFN-β、IL-1β的水平均明显升高。此外，STING信号通路激活降低了LPS诱导的脓毒症小鼠的生存率。 　　3.枯否细胞STING信号通路激活促进LPS诱导的脓毒症小鼠肝细胞死亡 　　STINGgt小鼠在给予LPS处理后，肝细胞中Cleaved caspase3表达和MLKL磷酸化水平较野生型小鼠LPS处理组均明显下降，而给予DMX处理的小鼠在接受LPS刺激后，肝细胞中Cleaved caspase3表达和MLKL磷酸化水平较野生型小鼠LPS处理组均明显升高。接受STINGgt LPS组枯否细胞条件培养基刺激的肝细胞的死亡比例及肝细胞培养上清中的ALT和AST水平较对照组明显下降，而接受DMX LPS组枯否细胞条件培养基刺激的肝细胞的死亡比例及肝细胞培养上清中的AST水平较对照组明显升高。 　　第二部分:线粒体分裂释放mtDNA介导枯否细胞STING信号通路激活 　　1.DRP1介导的线粒体分裂促进LPS诱导的枯否细胞STING信号通路激活 　　LPS诱导的脓毒症小鼠原代枯否细胞中DRP1蛋白Ser616位点磷酸化水平明显升高。转染shDRP1下调枯否细胞中DRP1的表达后，抑制了LPS诱导的枯否细胞线粒体分裂和STING信号通路激活。 　　2.DRP1介导释放的mtDNA激活了枯否细胞STING信号通路 　　枯否细胞转染shDRP1后，给予LPS刺激，胞质中dsDNA数量以及胞质中线粒体mtDNA片段D-loop的含量较NC shRNA+LPS组明显下降。而枯否细胞过表达DRP1后，显著增加了LPS诱导的mtDNA释放，转染DNase Ⅰ显著降低DRP1过表达引起的D-loop水平升高，并抑制了STING信号通路下游炎症因子IFN-β的表达。 　　3.LPS促进枯否细胞内VDAC1蛋白寡聚化 　　以100 ng/mL的LPS刺激枯否细胞，随着刺激时间的延长(至24 h)，细胞活力未受到明显影响;给予LPS浓度小于500 ng/mL刺激时间为12h时，细胞活力无明显变化，在LPS浓度达到1000 ng/mL时，细胞活力才出现明显下降，而在LPS处理的枯否细胞内VDAC1二聚体、三聚体的形成较对照组明显增加，提示在本研究中LPS刺激枯否细胞后，胞质中mtDNA与细胞凋亡无关，可能是通过VDAC1寡聚化孔道释放的。 　　4.DRP1依赖的线粒体氧化应激增强了mtDNA释放及STING信号通路激活 　　枯否细胞转染shDRP1后，给予LPS刺激，mtROS水平较NC shRNA+LPS组明显下降。应用线粒体抗氧化剂MitoQ后，胞质内D-loop含量及STING信号通路下游炎症因子IFN-β mRNA水平较DMSO+LPS组明显下降。 　　5.Mdivi-1抑制线粒体分裂抑制LPS诱导的脓毒症小鼠肝枯否细胞STING信号通路激活，减轻肝损伤给予Mdivi-1后，LPS诱导的脓毒症小鼠肝枯否细胞内STING信号通路被抑制，血清中炎症因子IFN-β、TNF-α、IL-1β的水平明显下降，肝细胞死亡比例、肝脏病理评分、以及肝酶(ALT和AST)水平均显著降低。 　　研究结论: 　　1.枯否细胞STING信号通路激活促进LPS诱导的脓毒症小鼠肝细胞死亡，导致肝损伤。 　　2.LPS诱导的脓毒症小鼠肝枯否细胞中DRP1介导的线粒体分裂促进了mtROS生成和mtDNA释放导致其STING信号通路激活。