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摘要本科研工作来源为美国南加州大学洛杉矶儿童医院Yong-MiKim教授NIHR01白血病微环境课题。<br>　　研究目的和意义:近年来儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的预后得到明显提升，但成人的ALL预后并不理想，而且所有难治复发的ALL病人预后极差。本课题主要基于经典的细胞粘附介导化疗耐药(CAM-DR)学说为背景。其中，整合素α4是一种重要的细胞粘附蛋白，PI3K/AKT和BRD4/c-Myc通路参与整合素下游细胞信号。故本课题将基于CAM-DR机制探索两个潜在可用于治疗难治复发B-ALL的新型药物的临床前期作用及其机制，一种是可口服的整合素α4β1小分子拮抗剂AVA4746，另一种是PI3Kδ-BRD4双重拮抗剂SF3535。希望通过这两种靶点给难治复发B-ALL治疗策略提供新思路和理论基础。<br>　　研究方法:通过难治复发B细胞ALL病人来源小鼠移植(PDX)模型，进行体内外实验研究，对AVA4746和SF2535两种小分子拮抗剂进行临床前期的生物学效应评估。AVA4746研究中，(1)流式细胞学测定Integrinα4表达、(2)VLA-4构象激活试验评估AVA4746与VCAM-1的VLA-4竞争结合力、(3)WesternBlot方法测定整体Integrinα4蛋白表达情况、(4)细胞粘附试验和去粘附试验评估粘附作用、(5)通过HUVEC细胞体外血管形成试验评估血管形成作用、(6)通过细胞内活性氧ROS水平检测以及Seahorse实时细胞代谢分析评估氧化代谢作用、(7)动物体内试验评估AVA4746对B-ALL细胞的骨髓动员作用以及联合化疗VDL对B-ALL小鼠的生存期评估。SF2535研究中，(1)通过ChIP-qPCR评估SF2535对B-ALL细胞中c-MycPromoter的靶点效应、qPCR评估SF2535对c-MycmRNA转录水平影响、WesternBlot评估SF2535对c-Myc蛋白水平的影响以及降解途径，(2)通过血清剥夺实验及WesternBlot方法评估SF2535对PI3K/p-AKT的影响，(3)通过凋亡实验以及WesternBlot明确SF2535对B-ALL起凋亡作用及凋亡途径，(4)通过流式细胞检测法检测SF2535对细胞周期的影响，(5)通过TrypanBlue染色细胞计数法明确SF2535对细胞增殖效应，(6)通过流式细胞检测细胞粘附分子的影响以及粘附试验明确其粘附效应，(7)通过动物体内实验明确SF2535对B-ALL细胞的减瘤作用。<br>　　主要结果:(1)B-ALL普遍表达整合素α4、PI3K、BRD4;(2)AVA4746可强有力竞争性拮抗VCAM-1与B-ALL细胞相结合;(3)AVA4746显著降低B-ALL细胞整合素α4表达;(4)AVA4746明确可使B-ALL细胞脱粘附于VCAM-1配体;(5)AVA4746对骨髓内微小残留白血病具有潜在动员效果;(6)AVA4746影响血管内皮细胞体外血管形成能力;(7)AVA4746可使难治复发B-ALL-PDX小鼠对化疗增敏;(8)AVA4746影响B-ALL细胞代谢水平;(9)SF2535显著下调难治复发B-ALL细胞中c-Myc和磷酸化(p)-AKT表达;(10)SF2535明显诱导难治复发B-ALL细胞凋亡是通过内源性凋亡通路;(11)SF2535可影响细胞周期改变及抑制细胞增殖;(12)SF2535影响细胞粘附分子改变;(13)SF2535降低难治复发B-ALL-PDX小鼠外周血白血病负荷。<br>　　结论:Integrinα4拮抗剂AVA4746和PI3Kδ-BRD4拮抗剂SF2535均在临床前期治疗B-ALL产生良好的生物学效果。<br>　　创新点:这两种基于CAM-DR学说研发的临床前期药物具有高度的临床转化能力，给难治复发B-ALL带来新的靶点策略。