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摘要研究背景<br>　　穴位敏化的研究是近年来的研究热点。近年来，一些在国际大样本针灸临床研究一方面肯定了针灸对软组织病变及某些痛症有一定的治疗作用[1]，但同时也证明旁开穴位的小微针刺(mini-acupuncture)的假针针束也有大致相同的治疗作用[2]。因此对穴位是否存在及其部位大小提出了质疑。面对这一质疑，我们通过观察穴位敏化的现象，发现疾病状态下穴位会出现感觉异变和区域范围的扩大，提出疾病状态下穴位发生了“敏化”。近年来对穴位本态的研究表明，穴位可塑性是疾病过程中体表出现的一种以神经源性炎性反应为主的动态改变[3]，并且存在多种理化变化和生物活性物质的改变。临床上，穴位敏化首先表现为穴位局部的感觉异变，如冠心病患者心脏发生缺血性病变时，患者其相应节段(T1～T5)神经支配皮节区域发生规律性的牵涉性的“敏化”反应[4]。其次，敏化穴位局部可能存在微环境及温度等多种差异[5-6]。这些临床上穴位的疾病状态下感觉异常的变化说明穴位是疾病的反应，其感觉异常必然伴随着局部理化特征的改变，对于临床选穴，探索穴位的本质具有一定的参考价值。<br>　　在动物实验中，以往的研究常通过对大鼠尾静脉注射伊文氏蓝，观察其体表渗出的情况来反映局部的血浆渗出，寻找病变引起的敏化区域（可能的穴区）[7]。学者们观察到体表这种EB渗出区域和穴位的出现有一定的相关性，而且这些相关的穴位与病变靶器官的神经节段的分布有一定的关联。进一步的机制研究表明，来自胃黏膜的伤害性信息经背根神经节顺向激活脊髓背角细胞，并由逆向的背根反射使相邻节段的神经末梢释放伤害性神经肽如substanceP(SP)和calcitoningenerelatedpeptide(CGRP)等，SP进一步刺激肥大细胞聚集和脱颗粒，释放致痛物质如组织胺(HA)和五羟色胺(5-HT)，后者作用于血管引起血管扩张和血浆渗出;如此形成感觉异常，伴随局部理化微环境的“穴位敏化池”[8]。而除感觉神经外，交感神经可能也参与了这种神经源性炎性反应。交感神经一方面释放去甲肾上腺素于毛细血管前血管，使得血管平滑肌收缩[9]，另一方面节后纤维释放前列腺素(PGE2)作用于毛细血管后静脉从而影响炎性反应的发生和发展[10]。因此，这些研究提示交感神经也可能参与穴位敏化的形成。<br>　　根据以上研究，本研究以结肠炎大鼠模型为观察对象，以尾静脉注射EB标记敏化穴区，首先观察结肠炎模型大鼠体表敏化区域神经皮节的分布规律，测定其机械痛阈、温度、血流。其次从感觉神经参与神经源性炎性反应的角度观察感觉神经末梢神经肽的变化;观察交感神经在此神经源性炎性反应中的作用;以及敏化区域局部促/抗炎细胞因子与HPA轴相关激素含量的变化，最后分析敏化区域差异蛋白，为进一步丰富“穴位敏化”理论供实验依据。<br>　　研究目的<br>　　本研究旨在阐释敏化穴位的理化性质及其生物活性物质基础。观察结肠炎模型大鼠体表敏化区域的分布规律及其与穴位的相关性，检测其痛阈、温度、血流变化;观察神经肽和酪氨酸羟化酶(TH)的局部表达，探索可能参与“穴位敏化”的差异蛋白;观察敏化区域的炎性因子及HPA轴相关激素adreno-cortico-tropic-hormone(ACTH)、CorticotrophinReleasingFactor(CRF)、Corticosterone(CORT)含量的变化，并分析了CORT与促炎因子的相关性。通过以上研究，为进一步揭示“穴位敏化”的内涵提供依据。<br>　　研究方法<br>　　本实验研究主要分为4个部分:<br>　　(1)结肠炎模型的制备及敏化区域的确定:将雄性SD大鼠随机分为正常组和模型组，模型组大鼠5％葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液自由饮用6天，建立大鼠结肠炎模型，正常组大鼠饮用纯水。造模后第7天，两组大鼠经尾静脉注射伊文氏蓝(Evansblue，EB)溶液。根据模型组大鼠体表蓝色渗出点分布确定敏化区域，用于进一步研究。<br>　　(2)观察敏化区域痛阈、温度、血流的变化:在第(1)部分实验结果的基础上，以敏化区域旁开0.5厘米，同一神经节段支配区域为对照区域，分别采用小动物疼痛测试仪、红外成像技术、激光散斑技术对结肠炎模型大鼠敏化区域及对照区域的机械痛阈、温度、血流进行检测。<br>　　(3)研究交感神经与感觉神经介导的神经源性炎性反应与敏化区域形成的关系:采用免疫荧光染色技术，研究结肠炎模型大鼠敏化区域及对照区域P物质(SP)阳性神经纤维分布，与肥大细胞类胰蛋白酶(tryptase)及5-HT的表达，以及降钙素基因相关肽(CGRP)、酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经纤维分布与血管的关系;采用蛋白组学技术，探索结肠炎大鼠EB渗出点相关差异蛋白及其表达的变化。<br>　　(4)观察敏化区域局部炎性反应相关因子含量的变化:采用MSD多因子和ELISA检测技术观察敏化区域局部炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-1β、KC/GRO、IL-5、IL-13、IL-4、IL-10)、HPA轴相关激素adreno-cortico-tropic-hormone(ACTH)、CorticotrophinReleasingFactor(CRF)、Corticosterone(CORT)含量的变化。<br>　　以上每组大鼠数量不少于5只。<br>　　实验结果<br>　　1.结肠炎大鼠模型的确定和敏化(EB渗出)区域在体表的分布<br>　　大鼠饮用DSS6天后，出现明显的腹泻与便血(P＜0.05)，足底机械痛阈降低，结肠黏膜损伤明显，上皮细胞排列紊乱，甚至消失，隐窝破坏，黏膜下层水肿，并有大量的炎性粒细胞浸润，促炎因子含量升高（P均＜0.05），说明结肠炎造模成功。经尾静脉注射EB后，模型组大鼠体表T12-S1神经节段的皮肤出现较多的蓝色EB渗出点，说明结肠炎模型大鼠相应神经节段皮肤出现血管渗出，以L2-5节段较为集中，其中足三里-上巨虚区域出现EB渗出的百分率为53.6％。<br>　　2.敏化区域的机械痛阈、温度、血流变化<br>　　对结肠炎模型大鼠敏化区域（EB渗出点）的机械痛阈、温度、血流进行检测，观察到敏化区域的机械痛阈较对照区域显著降低(P＜0.05)，而敏化区域的温度显著升高(P＜0.05)，血流灌注显著增加(P＜0.05)。<br>　　3.感觉神经及交感神经参与体表敏化区域神经源性炎性反应<br>　　采用免疫组织化学标记了敏化穴区的神经肽SP和CGRP标记的神经末梢，结果表明:敏化区域SP和CGRP阳性神经纤维在血管周围表达均较对照区域明显增多(P＜0.05)。而且SP阳性神经纤维和类胰蛋白酶（tryptase）阳性标记的肥大细胞在血管周围形成紧密联系。同时，敏化区域类胰蛋白酶阳性肥大细胞较对照区域表达显著增多（P＜0.05），且出现肥大细胞脱颗粒，这些颗粒为5-HT阳性。此外，敏化区域C3蛋白含量显著升高（P＜0.05），说明补体系统可能参与了神经源性炎性反应的产生。<br>　　我们采用免疫荧光标记了敏化区域的酪氨酸羟化酶(Tyrosinehydroxylase，TH)，以此来确定标记的交感神经纤维。观察到敏化区域TH阳性神经纤维在血管周围表达较对照区域显著增加(P＜0.05)。而采用胍乙啶阻断交感神经后，结肠炎模型大鼠EB渗出明显减少(P＜0.05)。说明交感神经参与结肠炎引起的体表EB渗出，参与了内脏病变导致的体表神经源性炎性反应。<br>　　4.敏化区域促炎/抗炎细胞因子的释放及其和抗炎物质CORT的含量变化的相关性<br>　　我们对结肠炎模型大鼠敏化区域及对照区域（EB渗出区域旁开0.5厘米，同一神经节段支配区域）的炎性相关细胞因子以及抗炎物质Corticosterone(CORT)含量进行检测，观察到:模型组大鼠敏化区域的促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、KC/GRO含量较对照区域均显著升高(P＜0.05)。而抗炎细胞因子IL-4，IL-10含量没有明显改变(P＞0.05)。而敏化区域的CORT含量显著升高(P＜0.05)。对CORT及炎性因子相关性分析表明:敏化区域CORT与TNF-α、IL-6含量呈明显的负相关（P均＜0.05），但对照区域含量相关性不显著(P均＞0.05)。<br>　　以上结果提示:结肠炎模型大鼠T12-S1神经节段的皮肤出现血管渗出，以L2-L5节段较为集中;在此区域出现痛阈明显降低，而且温度和血流灌注明显升高;局部出现炎症因子和CORT含量显著增加，并有显著相关性。感觉神经与交感神经引起的神经源性炎性反应参与体表“穴位敏化池”的形成。<br>　　结论<br>　　结肠炎模型大鼠在体表相应区域出现了敏化，表现为机械痛敏以及温度和血流的增加，并形成以神经肽(SP、CGRP)和炎性因子增加为主的“穴位敏化池”，同时启动抗炎物质CORT的增加，交感神经相关的TH增加，这一局部神经源性炎性反应形成可能是穴位敏化的科学基础。