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摘要基于碱基编辑器的基因治疗和基于多能干细胞(pluripotent stem cells，PSC)的再生医学治疗有望成为治愈疾病的新手段。但是碱基编辑器有脱靶风险、干细胞存在致瘤性风险，二者在实际应用中均存在安全隐患。本研究拟通过在腺嘌呤碱基编辑器中引入双导航系统，在胚胎干细胞中引入条件性表达自杀系统的策略，分别解决其对应的基因脱靶编辑和致瘤性问题，从而提高治疗安全性，推动二者的临床应用。<br>　　腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor, ABE)，由腺嘌呤脱氨酶、切口酶Cas9(nickase Cas9，nCas9)及起导航作用的gRNA组成，可实现DNA靶位点的A-to-G高效单碱基转换。然而，ABE具有明显的脱靶编辑效应，其中Cas9依赖性DNA脱靶目前仍未得到有效解决，所以ABE的临床应用仍存在安全隐患。<br>　　为了解决这一问题，我们设计在ABE中引入双导航器的方案，即将转录激活因子样效应子(transcriptionactivator-like effector, TALE)与腺苷脱氨酶融合、gRNA与nCas9联合，构建了新型碱基编辑器TaC9-ABE。在该系统中，gRNA/nCas9复合物通过gRNA的引导与目标DNA位点结合，在nCas9的作用下打开DNA双链，切割靶向单链DNA(single-stranded DNA, ssDNA)。脱氨酶融合蛋白在TALE的引导下与另一条ssDNA上的靶序列结合，并对结合位点上的腺嘌呤进行脱氨。只有两个组分同时结合到靶位点，才能最终实现目标位点从A到G突变。<br>　　在本研究中，我们经过多轮结构优化（包括脱氨酶的融合位点，两者连接子的长度，以及TALE与gRNA靶向位点的距离等），建立了高效的TaC9-ABE基因编辑系统。实验结果证明，TaC9-ABE碱基编辑器对不同人类细胞系中的多个基因位点都能进行有效的编辑。双导航器靶向位点的最佳距离在6-12 bp内，改变识别区间的距离可以控制编辑窗口的大小。利用该工具通过原核注射的方法对兔胚胎的三个基因位点OTC-1、OTC-2和DMD进行体内编辑获得了接近或高于ABE7.10的编辑效果。此外，我们对7个基因位点编辑后对应的40个Cas9依赖性脱靶位点和25个TALE依赖性脱靶位点进行深度测序发现，TaC9-ABE在保持高效的基因编辑效率的前提下，没有检测到Cas9和TALE依赖性脱靶，而经典ABE7.10编辑器在约50％的预测脱靶位点出现了脱靶编辑。以上结果表明，TaC9-ABE碱基编辑器可基本解决Cas9依赖性脱靶问题。<br>　　多能干细胞具有自我更新和多向分化潜能，是再生医学领域的重要研究材料。但是，PSC来源的细胞移植后有致瘤性的风险。为了解决这一问题，我们设计了一个由OCT4启动子驱动可诱导表达自杀基因(inducible caspase-9，iCasp9)的新策略(OCT4-iCasp9)。由于OCT4只在多能干细胞中表达，且iCasp9会在化学诱导药物(chemical induction drug，CID)作用下启动凋亡程序，导致细胞自杀。因此，在该策略下CID可有效清除移植物中残留的多能细胞，而不干扰已分化不表达OCT4的功能性细胞，从而建立一种干细胞治疗的新型安全策略。<br>　　在本研究中，我们建立了四种分别来源于人和小鼠的携带安全开关的多能干细胞系(H9P、HT9、M9P和MT9)。体外实验证明，H9P/M9P细胞系能在两小时内快速、特异性响应CID的凋亡诱导，且CID对已分化细胞如神经干细胞，和未编辑细胞没有杀伤作用。体内实验证明，未给药处理的H9P细胞在移植两周后，体内仍有大量细胞保持未分化状态。对H9P/M9P细胞进行移植前、移植同时和移植后早期给药处理，均能有效抑制体内畸胎瘤形成。以上结果表明，OCT4-iCasp9系统可作为一种直接、迅速的安全策略，减少多能干细胞治疗过程中的肿瘤发生。<br>　　综上所述，我们首次构建了低脱靶风险的新型单碱基编辑工具TaC9-ABE，以及携带可诱导自杀开关(OCT4-iCasp9)的多能干细胞系。相比于现有的细胞与基因治疗技术，这两种策略安全性更高，有望在未来临床治疗中发挥重要价值。