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摘要第一部分人圆形精子细胞的体外鉴别分选<br>　　背景和目的:<br>　　无精子症(azoospermia)患者在人群中的发病率为1％，其中60％为非梗阻性无精子症(non-obstructiveazoospermia，NOA)。将精液或者睾丸中取出的成熟精子的前体细胞（圆形精子细胞）注入卵子来进行助孕的技术被称为圆形精细胞注射术(roundspermatocyteinjection，ROSI)，借用ROSI技术助孕可以使没有成熟精子但是有圆形精子细胞的症患者获得自己生物学的后代。既往研究均表明使用圆形精子细胞的ROSI的受精率显著低于使用长形精子细胞和精子的卵胞浆内单精子注射术(intracytoplasmicsperminjection，ICSI)，而ROSI目前面临的最大挑战之一就是准确识别圆形精子细胞，因而，如何准确非侵入性识别圆形精子细胞是ROSI成功的关键也是技术难点。本研究从建立各期生精细胞图谱出发，同时利用流式细胞仪器根据细胞DNA倍性分选单倍体圆形精子细胞、睾丸生精细胞，瑞氏染色后与生精细胞图谱反复比对，探索在相差显微镜下和微分干涉显微镜下体外识别和挑选圆形精子细胞。<br>　　材料和方法:<br>　　本研究采用2019-2021年在河南省人民医院生殖医学中心男科行OA和NOA显微取精时，患者捐献的睾丸组织。收集患者一般资料和手术信息。本项目已经通过医院伦理审核。在手术时获取的睾丸组织利用两步酶法解离睾丸组织获得各期生精细胞悬液，然后进行以下三项实验鉴别和挑选精子细胞:1.免疫荧光检测睾丸生精细胞并总结其形态学和物理学特征，建立人各级生精细胞荧光学谱系;2.流式细胞学倍性分选单倍体精子细胞;3生精细胞瑞氏染色后结合生精细胞荧光染色图谱，经过反复和瑞氏染色细胞形态学和荧光学图谱比对，利用普通相差显微镜和微分干涉显微镜对圆形精子细胞进行鉴别和挑选。<br>　　结果:<br>　　1.我们先通过对各级生精细胞进行标记物免疫荧光染色，观察它们的形态学特征，并测定其细胞直径，并针对精子细胞总结了其形态特点（细胞大小、形状，细胞核形态，核质比，染色质特征等），初步建立人各级生精细胞谱系。<br>　　2.根据生精细胞荧光图谱和瑞氏染色形态学特征显示总结生精细胞形态学特征:测量精原细胞直径为7-12um，细胞核较大，核质相对比较大，可见核仁，可观察到突起的伪足;初级精母细胞直径12-15um，细胞核可见松散染色质，可见核仁;圆形精子细胞直径6-9um，细胞核高度浓缩而变小，核质比例较小，部分细胞内可见有顶体囊泡或帽状体，未见伪足。在光镜下可以进行识别和挑选圆形精子细胞<br>　　结论:<br>　　我们依据各级生精细胞标记物免疫荧光染色，总结其形态特点。同时针对精子细胞，重点检测其细胞学形态学指标（细胞大小、形状，细胞核形态，核质比，染色质特征等），初步建立了人各级生精细胞荧光学谱系。基于生精细胞荧光图谱，并参考生精细胞瑞氏染色细胞学形态学特征，总结生精细胞形态学特征。根据生精细胞学特征，初步建立一种圆形精子细胞鉴定和分选的方法，这可以为提高ROSI受精率和临床妊娠率提供重要的参考依据。<br>　　第二部分小鼠精子细胞冻融体系的优化<br>　　目的:<br>　　将未性成熟小鼠各级生精细胞利用不同的精子细胞冻存保护剂进行低温冻存，分析解冻后生精细胞回收率、复苏率和凋亡率，以期寻找更佳的用于ROSI的生精细胞冻融保护方案。<br>　　方法:<br>　　取2周龄的雄性小鼠用两步酶法制备睾丸细胞悬液(TCS，testicularcellsuspension)，根据DMEM/F12培养基中不同浓度的二甲基亚砜(DMSO，dimethylsulfoxide)、蔗糖、海藻糖的组合将冻存保护剂分为5组:A组含10％DMSO和10％胎牛血清(FBS，FoetalBovineSerum);B组含10％DMSO、0.1M蔗糖和10％FBS;C组含10％DMSO、0.1M海藻糖和10％FBS;D组含15％DMSO、0.1M蔗糖0.1M海藻糖和10％FBS;E组含10％DMSO、0.1M蔗糖、0.1M海藻糖和10％FBS。将5组睾丸生殖细胞悬液采用程序化方式冻存于液氮中，2个月后进行复苏。先用台盼蓝染色检测各组细胞活性，计算各组细胞冻存后的细胞活率和复苏率，然后用流式细胞仪检测睾丸生殖细胞的凋亡和线粒体膜电位的变化，并以新鲜消化提取的睾丸生殖细胞作为对照组进行对比。<br>　　结果:<br>　　与冻存前比较，冻存复苏后各组细胞活率均显著下降（P＜0.05)，而冻存组中E组细胞活率下降程度最低[(83.03±1.61)％]、细胞复苏率最高[(87.37±1.66)％]（P＜0.05）。细胞凋亡比较中，冻存复苏后各组细胞凋亡率均显著高于对照组[(18.77±0.95)％]（P＜0.05），其中A组细胞的凋亡率最高[(57.08±2.4)％]、E组细胞的凋亡率最低[(29.62±1.95)％](P＜0.05)。在线粒体膜电位的比较中，各组复苏后细胞线粒体膜电位均低于冻存前，除E组外，其余4组均显著低于对照组（P＜0.05)，而冻存的5组中E组下降程度最低，差异具有统计学意义（P＜0.05)。<br>　　结论:<br>　　不同冷冻保护剂对性未成熟小鼠睾丸生殖细胞冻存效果有显著的影响，其中含有10％DMSO，0.1M蔗糖，0.1M海藻糖，10％HBS的DMEM/F12培养基组合冷冻剂方案是冻存性未成熟小鼠睾丸生精细胞较适宜的冷冻保护剂方案。