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摘要糖皮质激素(Glucocorticoid，GC)被广泛应用于治疗自身免疫系统疾病、过敏性疾病、器官移植、严重感染等。长期使用或短期内大剂量使用GC易引发激素性骨坏死(Steroid-associated osteonecrosis，SAON)。SAON可累及全身，多发于负重较大的髋关节和膝关节，也发生于骨干或骨干骺端。其中，激素性股骨头坏死(Steroid-associated osteonecrosis of the femoral head，SONFH)临床危害最大，致残率最高。一旦发生SONFH，若未及时进行干预治疗，1-3年内约有80％的SONFH会发生软骨下骨塌陷。目前针对SONFH的所有保髋治疗只能延缓发病进程，最终仍需进行全关节置换。而激素性股骨干梗死(Steroid-associatedosteonecrosis of the femoral diaphysis，SONFD)通常无症状，骨科医生大多认为其本身的临床后果并不严重，因此常被忽略。然而一旦SONFD区发生创伤，如跌倒、车祸、手术等导致的骨折或骨缺损，则易并发骨不连或修复延迟等严重后果。而目前关于SONFD的研究较少，对SONFD病理学认识大多来自于对SONFH的研究积累，因此很有必要去阐明SONFD的病理特征，挖掘新的修复机制，发展一种有效的治疗策略，可同时用于缓解小梁骨和皮质骨的SAON病理进程。<br>　　破坏性骨修复是SONFH发生软骨下骨塌陷的主要原因。本课题基于前期对破坏性骨修复病生理机制的初步研究和积累，已确定该病理状态下的血管事件和骨骼事件的具体表现为:1）骨坏死区持续活化的血管内皮生长因子(Vascularendothelial growth factor，VEGF)-Src信号介导的新生血管功能缺陷及破骨细胞形成和功能增加;2）大量GC使用导致的骨髓干细胞池减小及成骨分化不足，是诱发“破坏性”骨修复的主要原因。因此，改善新生血管功能，调控破骨细胞活性，同时扩增骨髓干细胞促进新骨形成，是抑制坏死区发生破坏性骨修复促进重建性骨修复的关键点。血小板衍化生长因子-BB(Platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB)是一种偶联血管再生和骨再生的调节因子，目前已商业化用于骨缺损修复。研究发现，骨组织来源的PDGF-BB能够特异性地促进与骨重建密切相关的CD31 hiEmcnhi型（H型）血管形成并偶联新骨形成。另外，在骨干发生损伤时，PDGF-BB还可上调骨膜中骨膜素(Periostin)表达水平，稳定骨膜微环境促进骨膜再生，招募骨膜干细胞(Periosteum-derived cells，PDCs)迁移至皮质骨表面，加速皮质骨损伤处的修复重建过程。因此，我们推测PDGF-BB是介导小梁骨和皮质骨SAON病变区发生重建性骨修复的关键因子，对SONFH和SONFD皆有潜在的治疗作用。<br>　　本课题立足于GC在疾病中的应用，采用脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)联合甲强龙(Methylprednisolone，MPS)注射来构建符合人类临床病理特征的SAON破坏性骨修复家兔模型，并于第一次注射LPS后的第2、4、6周采用骨髓腔穿刺法在股骨近端骨髓腔内，局部注射1 μg/剂量或2μg/剂量PDGF-BB，25μg/剂量Anti-PDGF-BB，或同等剂量生理盐水。与此同时，对HUVECs，Raw 264.7细胞和C3H10T1/2细胞进行相应的病理生理刺激，构建与SAON破坏性骨修复病理条件相类似的细胞模型，体外考察PDGF-BB对血管再生、破骨吸收、新骨形成的作用模式。在实验终点时，通过影像学、组织学和细胞分子生物学等技术手段综合评价PDGF-BB对SONFH及SONFD的治疗作用，并进一步探讨其作用机制。<br>　　体外细胞模型实验揭示，PDGF-BB在疾病微环境中对血管功能、破骨细胞活性及成骨潜能均具有调控作用。首先，PDGF-BB可招募周细胞迁移至血管内皮细胞周围，稳定新生血管结构减少渗漏，调控VEGF介导的新生血管成熟和稳定。其次，低剂量PDGF-BB可调控破骨细胞活性，促进更多的破骨前体细胞的存活，减缓破骨细胞分化过程。最后，PDGF-BB可促进间充质干细胞增殖，并维持间充质干细胞在不同刺激条件下的存活，通过与PDGFR3作用调控Akt/GSK3β/CERE信号促进GC刺激的间充质干细胞实现自我更新;并通过与PDGFRα作用调控Akt/GSK3β/β-catenin信号，介导β-catenin入核，恢复其成骨分化潜能。<br>　　进一步的动物实验结果表明，采用LPS联合MPS注射造模，在第6周时SAON模型组SONFH发生率为80％，40％ SONFH进展为显性破坏性骨修复，40％ SONFH可发生显性重建性骨修复。基于Micro-CT的血管造影结果显示，SONFH血管结构受损，出现明显血管内物质渗漏;而组织学结果进一步证明SONFH病变区的血管内皮增生、增厚，新生血管通透性增加，骨髓水肿严重;同时SONFH软骨下骨区H型血管及瘦素受体阳性间充质干细胞(Leptin receptor-positive mesenchymal stem cells，LepR+ MSCs)数量减少。PDGF-BB治疗可显著缓解SONFH病理进程。结果显示，1μg/剂量或2μg/剂量的PDGF-BB治疗抑制了SONFH病变区发生破坏性骨修复，并介导50％-70％的SONFH发生重建性骨修复。进一步的体内生物学机制研究揭示PDGF-BB可促进SONFH软骨下骨区H型血管形成和Lep R+ MSCs增殖，进而调控血管再生和骨再生功能，改善软骨下骨体积骨密度（Volumetric bone mineral density，vBMD）。<br>　　与此同时，本实验还发现SONFH合并SONFD的发生率为100％。计量分析骨干中段2 cm的皮质骨和骨髓组织区域病变情况，结果显示在SAON模型组，SONFD区皮质骨坏死面积占比高达43.3％;且邻近SONFD区的骨髓组织表现出多种病变特征，其中20.6％的骨髓脂肪发生坏死，其它病变区分别由纤维化组织(35.6％)、炎性化组织(33.1％)、及随机分散的钙化组织(4.2％)替代;而且发生SONFD的骨干宏观结构、皮质骨组织学显微结构均发生显著变化;同时SONFD区骨膜退化，坏死区血管和神经消失，骨重塑能力减弱，未见明显成骨性骨修复。PDGF-BB治疗可显著改善SONFD的血供，降低SONFD发生率。1μg/剂量或2μg/剂量PDGF-BB治疗均可将SONFD的发生率降至25-37.5％，并将皮质骨坏死面积缩小至9.16-16.5％，同时抑制骨髓组织病变将正常骨髓组织区域占比扩增至86.3-88.8％（SAON模型组的正常骨髓组织仅占比5.5％）。其次，2 μg/剂量PDGF-BB还可显著上调股骨干骨外膜成骨能力，有效恢复股骨干宏观结构及皮质骨的组织学特征。<br>　　综上结果表明，在激素性骨坏死病理环境下，局部应用PDGF-BB可促进骨组织中H型血管形成和Lep R+ MSCs增殖，调控血管再生和骨再生，进而抑制破坏性骨修复促进重建性骨修复，最终缓解SAON病理进程;同时，PDGF-BB还可恢复股骨干血供，抑制皮质骨坏死和骨膜损伤，修复骨膜成骨能力，改善皮质骨宏、微观结构。PDGF-BB可同时调节血管再生、破骨吸收、新骨形成，对SONFH和SONFD皆具有潜在治疗作用。