TMPO--AS1吸附miR--498通过调控TMPO对甲状腺癌的影响-论文-万方医学网

TMPO--AS1吸附miR--498通过调控TMPO对甲状腺癌的影响

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摘要甲状腺癌(Thyroid cancer，TC)是最常见的内分泌恶性肿瘤，其发病率在世界范围内近几十年来呈快速增长趋势。虽然乳头状甲状腺癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)患者5年总生存率约为95％,但肿瘤可向远处器官和淋巴结转移，导致部分患者预后差，复发率高。因此，确定新的治疗策略以减少肺转移的发生率将实现长期缓解甲状腺癌患者，研究其潜在的分子机制对改善PTC患者的诊断和预后具有重要意义。 　　长链非编码RNA (Long non-coding RNAs，lncRNAs)由一组大于200个核苷酸的ncRNAs组成。大量研究表明，lncRNAs通过调控下游靶效应物参与人类病理。与临床实践相关，lncRNA可以作为潜在的标志物或治疗靶点，在不同类型的人类癌症中发挥作用。越来越多的研究表明，lncRNAs在调节细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭、耐药性和免疫应答等重要的细胞生物学功能中发挥着重要的作用。诸多研究在包括甲状腺癌在内的各种类型的癌症中观察到lncRNA的表达水平失调，然而它们在甲状腺癌中的作用和分子机制仍然很不清楚。TMPO反义RNA 1(TMPO-AS1)是位于染色体12p23.1区的反义lncRNA，由编码基因胸腺生成素(TMPO)5''端反义转录而来。TMPO-AS1已被鉴定为在多种癌症中参与细胞增殖的致癌基因。近年来，许多研究表明，TMPO-AS1作为一种致癌基因，在多种癌症中显著上调，并与预后不良和肿瘤进展有关。促胸腺生成素(Thymopoietin，TMPO)也被称为层状相关多肽2(LAP2)，有六种不同功能的选择性剪接异构体。TMPO可以与层膜和BAF相互作用，调节核结构的组织和细胞周期的动态。研究发现，TMPO在癌症生物学中发挥着重要的作用。根据生物信息学预测发现，TMPO-AS1与miR-498有结合序列，而TMPO是miR-498的靶基因，可推测TMPO-AS1吸附miR-498通过调控TMPO可能在癌症的发生发展过程中发挥着重要的作用。 　　本研究为探讨TMPO-AS1和TMPO在甲状腺癌中的表达情况及相关性，首先利用qRT-PCR和皮尔逊相关系数检测并分析了TCGA数据库的甲状腺癌组织中TMPO-AS1和TMPO表达情况并分析了其相关性，之后利用qRT-PCR检测了TMPO-AS1和TMPO在甲状腺癌组织中表达情况并也分析了其相关性，之后利用UCSC数据库分析TMPO-AS1和TMPO基因的位置关系，并使用双荧光素酶和免疫共沉淀验证TMPO-AS1和TMPO的关系;为研究干扰TMPO-AS1对甲状腺癌细胞生物学行为以及移植瘤生长的影响，首先利用qRT-PCR检测TMPO-AS1在甲状腺癌细胞系中表达情况，然后确认了TMPO-AS1在TPC-1和IHH-4细胞中的表达位置，并使用EdU、平板克隆、流式细胞术、TUNEL和Transwell检测了干扰TMPO-AS1对TPC-1和IHH-4细胞的增殖、克隆形成、凋亡、侵袭和迁移的影响，此外，并构建移植瘤裸鼠模型，探讨了体内干扰TMPO-AS1对甲状腺癌移植瘤生长的影响;为探讨TMPO-AS1吸附miR-498通过调控TMPO对甲状腺癌细胞功能的影响，利用免疫共沉淀和双荧光素酶实验检测TMPO-AS1、TMPO和miR-498之间的关系，并探讨了过表达miR-498对TPC-1和IHH-4细胞的增殖、克隆形成、凋亡、侵袭和迁移的影响，此外还分析了干扰TMPO对TPC-1和IHH-4细胞的增殖、克隆形成、凋亡、侵袭和迁移的影响，以及干扰TMPO-AS1并同时TMPO过表达回复实验对TPC-1细胞增殖、克隆形成、凋亡、侵袭和迁移的影响。 　　本研究主要分为三部分: 　　第一部分:TMPO-AS1和TMPO在甲状腺癌中的表达情况及相关性分析; 　　第二部分:干扰TMPO-AS1对甲状腺癌细胞生物学行为以及移植瘤生长的影响; 　　第三部分:TMPO-AS1吸附miR-498通过调控TMPO对甲状腺癌细胞功能的影响。 　　主要内容: 　　第一部分:TMPO-AS1和TMPO在甲状腺癌中的表达情况及相关性分析 　　方法： 　　1.利用qRT-PCR和皮尔逊相关系数检测并分析癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)数据库中TMPO-AS1和TMPO表达情况及相关性。 　　2.qRT-PCR检测在甲状腺癌组织中TMPO-AS1和TMPO表达情况及相关性分析。 　　3.UCSC数据库分析TMPO-AS1和TMPO基因的位置关系。 　　结果： 　　1.TCGA数据库分析显示，与339例癌旁组织相比，TMPO-AS1和TMPO在118例甲状腺癌组织中表达明显上调（*P＜0.05），且TMPO-AS1和TMPO表达水平呈现正相关，R=0.23，P=2.5e-07。 　　2.UCSC数据库分析发现，TMPO是基因组中TMPO-AS1附近的基因。 　　3.qRT-PCR检测发现，与邻近正常组织相比，TMPO-AS1和TMPO在甲状腺癌组织中表达上调（**P＜0.01），且TMPO-AS1和TMPO表达水平呈现正相关，R=0.625，P＜0.001。 　　结论： 　　甲状腺癌中TMPO-AS1和TMPO表达均明显上调，二者表达呈现正相关，且基因组中TMPO-AS1和TMPO距离较近。 　　第二部分:干扰TMPO-AS1对甲状腺癌细胞生物学行为以及移植瘤生长的影响 　　方法： 　　1.qRT-PCR检测甲状腺癌细胞中TMPO-AS1的表达情况。 　　2.细胞的核质分离技术和荧光原位杂交(FISH)检测TMPO-AS1在甲状腺癌中的表达位置。 　　3.设计shRNA序列，构建干扰TMPO-AS1慢病毒载体，包装后感染TPC-1和IHH-4细胞得到干扰TMPO-AS1稳定细胞系，用于后续功能研究。 　　4.EdU实验检测干扰TMPO-AS1对TPC-1和IHH-4细胞增殖的影响。 　　5.克隆形成实验检测干扰TMPO-AS1对TPC-1和IHH-4细胞克隆形成的影响。 　　6.原位末端标记法(TUNEL)实验检测干扰TMPO-AS1对TPC-1和IHH-4细胞凋亡的影响。 　　7.流式细胞术检测干扰TMPO-AS1对TPC-1和IHH-4细胞凋亡的影响。 　　8.Transwell检测干扰TMPO-AS1对TPC-1和IHH-4细胞侵袭的影响。 　　9.Transwell检测干扰TMPO-AS1对TPC-1和IHH-4细胞迁移的影响。 　　10.裸鼠移植瘤构建，分析干扰TMPO-AS1对甲状腺癌移植瘤生长的影响。 　　结果： 　　1.与对照组nthy-ori3-1细胞相比，TMPO-AS1在甲状腺癌细胞TPC-1、IHH-4、A-PTC、CUTC5中表达水平明显升高（**P＜0.01），其中在TPC-1和IHH-4细胞中表达最高。TMPO-AS1主要定位于TPC-1和IHH-4细胞的细胞质中。 　　2.干扰TMPO-AS1能够明显抑制TPC-1和IHH-4细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移以及甲状腺癌移植瘤的生长（**P＜0.01），促进细胞凋亡（**P＜0.01）。 　　结论： 　　甲状腺癌细胞中TMPO-AS1主要表达于细胞质中，其表达水平明显上调，且干扰TMPO-AS1能够抑制TPC-1和IHH-4细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移以及甲状腺癌移植瘤的生长，促进细胞凋亡。 　　第三部分:TMPO-AS1吸附miR-498通过调控TMPO对甲状腺癌细胞功能的影响 　　方法： 　　1.利用免疫共沉淀和双荧光素酶实验检测TMPO-AS1、TMPO和miR-498之间的关系。 　　2.利用EdU、克隆形成、TUNEL、流式细胞术和Transwell实验检测过表达miR-498和干扰TMPO对TPC-1和IHH-4细胞的增殖、克隆形成、凋亡、侵袭和迁移的影响。 　　3.利用EdU、克隆形成、TUNEL、流式细胞术和Transwell实验检测干扰TMPO-AS1并同时TMPO过表达回复实验对TPC-1细胞增殖、克隆形成、凋亡、侵袭和迁移的影响。 　　结果： 　　1.miR-498与TMPO-AS1有结合序列，而TMPO是miR-498的靶基因。miR-498过表达可以抑制TMPO的表达（**P＜0.01），并抑制甲状腺癌细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移（**P＜0.01），促进细胞的凋亡（**P＜0.01）。 　　2.干扰TMPO能够抑制甲状腺癌细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移（**P＜0.01），促进细胞的凋亡（**P＜0.01）。 　　3.干扰TMPO-AS1表达能够抑制甲状腺癌细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移（**P＜0.01），促进细胞的凋亡（**P＜0.01），而TMPO过表达能够逆转这种抑制和促进作用（**P＜0.01）。 　　结论： 　　TMPO-AS1吸附miR-498通过正向调节TMPO，可以促进甲状腺癌细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移，并抑制细胞的凋亡。 　　全文结论： 　　在甲状腺癌中，TMPO-AS1吸附miR-498可以调节TMPO的表达，进而可以促进癌细胞的增殖、克隆形成、侵袭和迁移以及移植瘤的生长，并抑制细胞凋亡，从而发挥促癌的作用。