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摘要蛋白质药物在疾病治疗方面具有重要的应用价值，但其稳定性差、半衰期短等特点限制了其在临床应用中的效果。目前，各类纳米材料被广泛用于增强蛋白质药物的活性。然而，现有的蛋白质药物递送系统在制备过程中常常会对蛋白质结构及功能造成损伤，导致活性降低。因此，发展新型蛋白质药物递送策略是提高临床治疗效果的关键途径。近年来，基于细菌的疾病治疗策略因其独特的机制而受到广泛关注。尤其是随着基因技术的快速发展，工程菌成为了活性蛋白质的“制药工厂”，为蛋白质药物的高效靶向性递送提供了解决方案。同时，由于细菌能感知炎性和癌症等疾病的微环境状态，能够选择性地在靶部位聚集，为实现蛋白质药物的定点分泌和释放，以及蛋白质药物的原位递送提供有益条件。此外，通过纳米材料对菌体表面进行改造，不仅能够赋予其多功能化并增强递送效率，而且进一步实现协同治疗策略。基于以上思路，本文构建了两种增强蛋白药物活性的递送系统，并开展了以下研究工作。<br>　　1.工程化益生菌口服药物递送系统的构建及治疗Ⅱ型糖尿病的初步应用<br>　　胰高血糖素样肽1 (Glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一种多肽类药物，具有促进胰岛β细胞的增殖和增强葡萄糖依赖性胰岛素分泌的特性，因此被认为是一种有效的糖尿病治疗药物。然而，由于其容易被体内蛋白酶降解、半衰期短(1-2 min)等原因，极大地限制了GLP-1的临床应用。本课题基于大肠杆菌Escherichia coli Nissle 1917 (EcN)益生菌设计了一种口服制剂(LEGD)，将表达GLP-1的质粒导入EcN菌体内，利用自组装策略在菌体外修饰一层脂膜，以抵抗胃肠道中的恶劣环境，最后系统性考察LEGD对糖尿病的治疗效果。该制剂旨在阻止高血糖的进展，并修复已损伤的胰岛β细胞的功能，有望在Ⅱ型糖尿病的治疗领域发挥潜在的应用价值。<br>　　透射电镜(Transmission electron microscopy，TEM)和激光共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscopy，CLSM）结果表明，脂膜有效且稳定地包封在EcN表面。同时，活性实验表明，脂膜的包封不影响菌体的活性和生长状态。体外的抗逆性实验证明，脂膜包封EcN (LEcN)可以显著增强EcN对胃酸的抵抗力。此外，EcN分泌的GLP-1可以结合胰岛β细胞表面受体，并刺激细胞产生环腺苷单磷酸(Cyclic adenosine monophosphate，cAMP)，进一步促进胰岛素的分泌。在此基础上，利用胰岛β细胞损伤模型，考察GLP-1对已损伤胰岛β细胞的修复效果。体外实验表明，GLP-1可以有效修复已损伤的胰岛β细胞，并在葡萄糖诱导下促进胰岛素的分泌。基于LEGD的优越特性，我们进一步评估了LEGD在糖尿病小鼠模型上的治疗效果。结果显示，LEGD能够显著改善糖尿病小鼠的高血糖状态，降低胰腺组织内的炎性反应。病理结果显示，在Ⅱ型糖尿病模型小鼠中，由于β细胞无法补偿葡萄糖代谢负荷，引起胰岛形态出现不规则现象并伴有淀粉样蛋白沉积。经LEGD治疗后，这些症状明显减轻，且胰岛形态更加规则、大小均匀并恢复正常化。同时，LEGD治疗后胰岛β细胞的数量和胰岛素的分泌均有所增加。相比之下，未经治疗的糖尿病小鼠大部分胰岛β细胞发生凋亡和损伤。此外，LEGD能够有效地改善胰腺炎性微环境，降低炎症因子的表达。肠道菌群分析表明，LEGD显著增加了乳酸菌科和双歧杆菌科等益生菌的丰度和多样性，并且有效调节了肠道菌群微环境，从而辅助糖尿病的治疗。通过定量蛋白质组学技术的分析，进一步证实LEGD在治疗糖尿病方面的作用机制。研究发现，LEGD可以调控胰岛素分泌和胆固醇代谢，并显著上调关键蛋白的表达。该口服制剂不仅减少了给药频率，而且稳定了治疗效果，为糖尿病治疗提供了一个独特的平台。<br>　　2.光热刺激原位可控型“蛋白胶囊”的构建及治疗乳腺癌的基础研究<br>　　近年来，细菌外膜囊泡作为一种仿生载体，在蛋白质药物递送方面展现出了良好的应用前景。然而，外膜囊泡提取物的回收率低和重复性差等问题限制了其体内应用及临床转化效率。因此，发展高效快速的体内原位生成囊泡的新型治疗策略，对于增强囊泡蛋白质药物递送具有重要意义。针对这一问题，本课题构建了一种光热刺激可控型“蛋白胶囊”原位递送系统。该系统可将封装目的蛋白的囊泡在肿瘤组织中进行原位可控型的高效释放，结合光热刺激引发的免疫反应，进一步增强其肿瘤治疗效果。<br>　　本研究首先构建了细菌内膜增殖蛋白(Atp-b)和天青素蛋白(Azurin)共表达质粒，并将该质粒转化到大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）中。通过利用类黑色素多巴胺(Polydopamine，pDA)的自身粘附性在菌体周围形成一层“纳米衣”(pDA-AAZU)。其中，该系统中Atp-b内膜蛋白的过表达，进一步增大了菌体内膜表面积。在光热刺激下，使之形成包封Azurin的“蛋白胶囊”。TEM结果显示，pDA能够在菌体表面形成一层较厚的黑色纳米粒涂层。活性实验表明，pDA的包封不影响菌体的活性和生长状态。在近红外光(Near-infrared light，NIR)的照射下，pDA-AAZU表现出明显的发热效果，且产生的高热能够引起菌体外膜破裂，促进内膜囊泡的形成和释放。纳米颗粒跟踪分析仪(Nano-particle tracing analyzer，NTA)结果表明，囊泡粒径主要分布在80-200 nm之间，并且随着光热刺激时间的增加，囊泡浓度也会相应提高。体外实验表明，光热刺激能够促进细胞对于囊泡的摄取，并增强囊泡的渗透能力。同时，pDA-AAZU可实现热疗和蛋白药物的协同治疗，促进肿瘤细胞的凋亡，具有较强的肿瘤细胞杀伤效果。体内药效实验结果表明，经NIR照射后，pDA-AAZU能够显著降低4T1荷瘤小鼠的相对瘤体积至1.41±0.36。治疗结束后，流式细胞仪检测结果表明，pDA-AAZU治疗可促进树突细胞(Dendritic cells，DCs)的招募和成熟，以及细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTLs)的增殖，同时降低免疫抑制性调节性T细胞（Immunosuppressive regulatory T cells，Tregs）的比例，从而增强了瘤内免疫效应性细胞的浸润，产生显著的抗肿瘤免疫治疗效应。ELISA检测结果表明，pDA-AAZU可促进肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干扰素γ（Interferon-γ，IFN-γ）和白介素6(Interleukin-6，IL-6)的分泌，降低免疫抑制因子白介素10 (Interleukin-10，IL-10)的分泌。此外，荷瘤小鼠肺转移结果表明，pDA-AAZU能够显著地抑制肿瘤病灶向肺组织部位的转移。小鼠的体重变化和组织形态的观察结果表明，pDA-AAZU给药系统在治疗过程中具有较高的生物安全性。综上所述，光热刺激原位可控型“蛋白胶囊”递送系统具有良好的抗肿瘤效果和生物安全性等特征，在肿瘤治疗方面具有潜在的应用价值。