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摘要肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是定植于人类上呼吸道的机会致病菌，可引起肺炎、中耳炎、脑膜炎、菌血症等疾病。肺炎链球菌依赖众多毒力因子，如荚膜多糖，溶血素(Pneumolysin，Ply)及过氧化氢(H2O2)等，逃脱人体免疫系统而侵袭宿主。与其他致病菌不同，肺炎链球菌因无触酶，而积累并耐受高浓度的H2O2。对高浓度H2O2的耐受能力使肺炎链球菌能够抵御人体固有免疫细胞产生的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)及活性氮(Reactive nitrogen species，RNS)的攻击，因而抗氧胁迫能力与肺炎链球菌的毒力密切相关。本实验室前期研究发现寡发酵链球菌的水通道蛋白(Aquaporin)促进H2O2跨膜转运，帮助细菌排出胞内的H2O2从而缓解氧化压力。水通道蛋白为固有膜蛋白(Integral membrane protein)，广泛存在于真核和原核生物中。真核生物的水通道蛋白协助水、甘油及尿素等不带电荷的小分子跨膜扩散，发挥重要生理功能。但目前对原核生物的水通道蛋白的生理功能研究较少。本研究通过系统发育分析、生理生化及遗传实验、细胞实验及小鼠肺炎感染模型等，证明肺炎链球菌的水通道蛋白Pn-AqpC代表了一类新型的水通道蛋白亚家族，特异性转运氧气进入肺炎链球菌细胞，提高H2O2产生并调动H2O2自免疫防御机制，从而提高肺炎链球菌的抗氧胁迫能力。同时，Pn-AqpC促进肺炎链球菌的自溶裂解，释放重要毒力因子Ply攻击宿主细胞。因此，氧转运蛋白Pn-AqpC在肺炎链球菌致病过程中发挥重要作用，是一个新的毒力相关蛋白。研究成果如下:<br>　　Pn-AqpC代表新的水通道蛋白亚家族，并促进氧气跨膜转运。系统发育分析表明Pn-AqpC与来自链球菌属(Streptococcus)、片球菌属（Pediococcus）、肠球菌属（Enterococcus）、乳球菌属（Lactococcus）、魏斯氏菌属(Weissella)以及乳杆菌属（Lactobacillus）的同源蛋白聚类成一个独立的亚分支，代表一类新型的水通道蛋白亚家族;氨基酸序列比对发现Pn-AqpC的底物选择性氨基酸与已报道的水型水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)和甘油型水通道蛋白(Aquaglyceroporins，AQGPs)均不同;Pn-AqpC的底物转运通道a/R处的直径介于AQPs和AQGPs之间，提示Pn-AqpC具有独特的底物转运谱。敲除Pn-aqpC导致肺炎链球菌的H2O2产量显著降低，同时细菌的耗氧量也下降，表明Pn-AqpC蛋白提高肺炎链球菌的氧气摄取能力;异源表达Pn-aqpC的酵母菌显著促进了氧气的跨膜转运;体外脂质体重组实验进一步证实Pn-AqpC特异性转运氧气、而不转运水和甘油穿过细胞膜;点突变实验确定Pn-AqpC的Pro232为氧气转运的关键氨基酸。因此，Pn-AqpC是一个“氧”孔蛋白。<br>　　Pn-AqpC提高肺炎链球菌的抗氧胁迫能力和毒力蛋白Ply的释放。通过模拟宿主生理氧水平，证明Pn-AqpC主要在低氧环境发挥功能，促进氧气的跨膜转运和肺炎链球菌H2O2产生;H2O2和NO胁迫实验表明，Pn-aqpC的缺失导致细菌的抗氧胁迫能力显著下降;而40 μM H2O2预处理可提高ΔPn-aqpC在高浓度H2O2和NO中的存活率，表明Pn-AqpC通过促进生理浓度的H2O2产生而赋予肺炎链球菌抗氧胁迫能力;细菌自溶及溶血实验证明，ΔPn-aqpC菌株的自溶裂解显著减缓，释放到培养液中的Ply活性也比野生型菌株下降4倍，说明Pn-AqpC促进细菌的自溶从而释放Ply;荧光蛋白融合实验表明，Pn-AqpC的表达受氧气诱导，支持其转运氧气的功能。<br>　　Pn-AqpC对肺炎链球菌的毒力有重要贡献。细菌与巨噬细胞共孵育实验表明，缺失Pn-aqpC导致肺炎链球菌更容易被巨噬细胞清除;同时由于Ply释放的减少，与ΔPn-aqpC菌株共孵育的巨噬细胞死亡率也显著下降;小鼠肺炎模型实验表明，相比野生型菌株，ΔPn-aqpC菌株对小鼠的致死率显著降低。因此Pn-AqpC显著贡献肺炎链球菌的毒力，是一个新的毒力相关蛋白。<br>　　Pn-AqpC可作为潜在的疫苗靶标。与巨噬细胞的共孵育实验发现，纯化的Pn-AqpC蛋白可引起部分巨噬细胞死亡，暗示Pn-AqpC蛋白可能是直接毒力因子;纯化的Pn-AqpC诱导巨噬细胞产生炎症因子TNF-α，而蛋白酶K处理Pn-AqpC则消除了巨噬细胞的炎症反应，同时Pn-AqpC蛋白胞外区的肽段作为免疫原制备的兔血清抗体可与肺炎链球菌结合，表明Pn-AqpC引起宿主炎症反应并可被免疫识别;由于Pn-AqpC在肺炎链球菌所有的血清型高度保守分布，因此可作为潜在的疫苗研发靶标。