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摘要细菌在有氧代谢过程中产生大量的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)。ROS的过量积累抑制细菌生长，严重时引起细菌死亡。寡发酵链球菌(Streptococcus oligofermentans)是本实验室分离自健康人口腔牙菌斑的有益链球菌。寡发酵链球菌不产生触酶，有氧代谢时产生并积累大量H2O2，同时也耐受高浓度的H2O2，暗示其具有独特的抗氧胁迫机制。我们前期研究发现，低浓度H2O2诱导寡发酵链球菌对高浓度H2O2的抗性，似H2O2“免疫”，初步发现与H2O2响应调控蛋白有关;高浓度H2O2胁迫导致寡发酵链球菌产生3小时的短暂生长停滞，表明细菌可修复氧化损伤恢复生长。但链球菌适应H2O2胁迫的机制尚未知。本论文综合应用氧化还原蛋白组学，生理生化及遗传学研究手段，在转录及翻译水平研究寡发酵链球菌的“H2O2自免疫”及其抗H2O2胁迫的分子机制，结果发现对H2O2敏感的含巯基蛋白发挥调控作用。主要研究结果如下:<br>　　一、氧化还原组学分析发现被氧化的含巯基的H2O2响应调控及功能蛋白<br>　　蛋白质巯基易被H2O2氧化，我们对40 μM H2O2及40 mL静置低氧培养物进行氧化还原蛋白组学分析。发现半胱氨酸被氧化蛋白，除氧化还原平衡蛋白，巯基过氧化物酶(Tpx)及硫氧还蛋白(Trx)，还有在抗H2O2胁迫发挥重要调控作用的金属离子转运抑制蛋白(MntR)和过氧化物响应抑制蛋白(PerR)。<br>　　二、低浓度H2O2氧化PerR蛋白的半胱氨酸，使之失活解除对调控氧化还原和金属离子平衡基因的转录抑制，提高链球菌抗高浓度H2O2胁迫<br>　　Redox Western blotting结合AMS标记证实40 μM H2O2氧化PerR的半胱氨酸;免疫共沉淀结合LC-MS/MS分析及半胱氨酸点突变证明，H2O2导致PerR的Cys139及Cys142巯基被氧化为SOH，即发生可逆性氧化（可被还原为巯基）。证明PerR的半胱氨酸对H2O2高度敏感，暗示其可能通过半胱氨酸氧化感应胞内的低浓度H2O2。电感耦合等离子质谱(ICP-MS)检测进一步证明PerR的半胱氨酸被H2O2氧化，从而导致PerR丢失Zn2+; EMSA实验发现被H2O2氧化的PerR失去结合其调控基因:铁离子螯合蛋白的基因(dpr)启动子的能力。<br>　　定量PCR表明氧化还原平衡基因如tpx、trx和金属离子平衡基因，如锰离子转运蛋白基因(mntA)和dpr均在H2O2处理的细菌中高表达，失活任何基因均削弱寡发酵链球菌抗H2O2的能力，说明它们是细菌抗氧化胁迫的功能基因。失活perR这些抗氧胁迫基因的表达不再响应H2O2，且perR缺失菌株完全丧失低“H2O2自诱导”的氧化胁迫抗性。证明H2O2氧化使PerR蛋白失活而解除对调控的抗氧胁迫基因表达的抑制，提高寡发酵链球菌抗高浓度H2O2胁迫的能力。<br>　　三、RNase Z被H2O2氧化降解而阻碍tRNA加工成熟，减缓了细菌翻译速率但提高其氧化适应性<br>　　寡发酵链球菌编码的50个tRNA的3''端均无CCA，因此其加工成熟由RNase Z完成，酶学实验也证明So-RNase Z加工tRNA前体的3''端。氧化还原蛋白组分析、非还原SDS-PAGE结合半胱氨酸点突变、重组表达蛋白、及Redox Western blotting实验证明，H2O2氧化细菌胞内的So-RNase Z蛋白的Cys38与Cys149，使之形成分子内二硫键，进而导致So-RNase Z降解。<br>　　Northern blotting实验发现H2O2处理的细菌中积累tRNA前体而成熟体减少，验证了RNase Z氧化失活的效应;嘌呤霉素掺入新生蛋白结合Western blotting实验发现H2O2处理的细菌减缓蛋白合成速率;而过表达So-RNase Z，不仅提高H2O2胁迫下细菌的蛋白合成速率，部分恢复菌株的生长，而且恢复了细菌的tRNA前体加工。然而，过表达So-RNase Z导致细菌在20mM H2O2中的存活率降低，这说明RNase Z氧化失活是链球菌适应H2O2的有利机制。<br>　　生物信息学分析显示So-RNase Z及其H2O2敏感的Cys残基广泛分布于链球菌科的细菌，且这些细菌的tRNA 3''端均无CCA（依赖RNase Z加工tRNA 3''端成熟）表明本工作发现的基于So-RNase Z的H2O2适应机制在不产生触酶的链球菌中被广泛使用。<br>　　综合以上，我们对寡发酵链球菌H2O2胁迫抗性及耐受的分子机制研究为寡发酵链球菌更好地拮抗龋齿致病菌提供了理论基础。