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摘要合成生物学是一门尝试利用工程学原理对生命系统进行改造和再创的交叉学科。其中一个重要研究方向是创造全新的人工基因线路，以理解自然和实现预期目标。根据以往的经验，已凝练出一些基因线路的设计原则，如绝缘化设计，模块化封装等，能够在一定水平上成功创造功能可理性预测的基因线路。人工基因线路的进一步外延会面对复杂遗传背景、环境因素扰动乃至进化不稳定性等问题，其对于基因线路中调控作用的干扰已变得不可忽视，极易造成预设功能的衰退甚至崩溃。在此背景下，需要继续探索在复杂环境条件下进行有效基因线路设计的新方法。<br>　　对天然生命系统的具体研究，解析出一类“精确自适应”现象，是生命体能够适应外部环境的波动，在长时间尺度下维持自身内稳态的一项基本属性。自适应功能对于合成的生命系统而言也同样重要。由此，本研究尝试设计并验证一类可执行“精确自适应”（Perfect Adaptation）功能的基因线路。为使基因线路能够在面对复杂条件扰动的情况下依然稳定有效地执行预设功能，我们具体进行了以下方面的研究探索:<br>　　(1)拓扑结构的选取:结合理论计算结果，考虑生物系统中结构复杂度和参数范围等约束，对可实现“精确自适应”功能的拓扑结构进行选择，最终确定“负反馈耦合正反馈”的拓扑结构，其必要约束条件为辅助节点构成低强度的自激活基因线路，且激活强度与激活基因元件浓度呈线性关系;<br>　　(2)基因元件表征与基因线路功能验证:参照该拓扑结构，选取了具体的满足约束条件的基因元件，使用T7 RNA聚合酶执行转录激活作用，CRISPRi/dCpf1执行转录抑制作用，对其完成功能定量表征，在大肠杆菌中组装成为完整的基因线路;从稳态和动态的角度对基因线路的行为进行了定量表征，在稳态水平上，面对输入信号约100倍的强度变化，基因线路的输出信号能保持基本不变，实现了对输入信号的“精确自适应”;在动态水平上，可观测到完整的“脉冲”式响应行为;<br>　　(3)构建可预测的生物物理模型:根据基因元件的分子生物学机制进行建模，使用基因元件和基因线路的定量实验数据完成参数拟合，得到了无自由参数的细致生物物理模型，强度参数扰动的仿真预测与独立实验验证结果高度一致;<br>　　(4)验证基因线路的鲁棒性:对拓扑结构中的所有三条单边互作强度进行了系统的扰动，替换六组相关的基因元件;在全部情况下，该基因线路都可实现精确自适应功能;而在完全敲除拓扑中的正反馈或负反馈的情况下，自适应的精度降低甚至丢失自适应功能;通过替换培养基碳源底物，改变底盘菌株的生长速率和全局代谢策略;迁移基因线路从原测试菌株DH10β至工业用菌株BW25113、跨系列菌株BL21以及跨物种的恶臭假单胞菌中;面对多种全局因素的改变，基因线路仍可以完成精确自适应功能。<br>　　总结以上研究与设计过程，本研究中搭建的精确自适应基因线路在面对信号强度变化、基因线路内互作强度变异、底盘全局因素调整等复杂情况时，均能够控制输出信号强度不改变，证实了该基因线路的精确自适应功能具有鲁棒性的性质。获得鲁棒性的核心在于，设计过程中对可定量、易定量的少量关键基因元件进行定量地精准刻画;对难以定量的其余多数基因元件进行定性表征确认。结合拓扑穷举的理论依据，将定量关键基因元件的内禀参数性质作为实现功能最核心的约束条件，从而能够放松对其余多数基因元件参数的精确度要求。我们将这种“精准约束可定量内禀参数、允许其余参数耐受扰动”的功能基因线路设计原则归纳为“精准鲁棒性”设计。在未来能够推动设计更丰富、多元、鲁棒的生物功能，有助于合成生物技术在更现实的环境条件下推广使用。