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摘要乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)的基因组具有非常特殊的结构特征，是一种松弛环状不完全双链DNA(relaxed-circleDNA，rcDNA);其负链完整，在5''端处有一段冗余的r片段，连接着病毒的聚合酶;其正链只有负链的30-70％,5''端处连接着一小段寡核糖核苷酸。当病毒感染细胞并将基因组释放到细胞核时，病毒利用宿主的DNA修复系统，将基因组修复成共价闭合环状DNA(covalent-closed-circularDNA，cccDNA)，在拓扑异构酶的帮助下，cccDNA形成超螺旋结构，作为微染色体存在于宿主基因组之外。这种稳定的病毒核酸形式是慢性乙肝无法完全治愈的重要原因。因而，对HBVcccDNA的形成和调控机制进行全面了解将有助于设计和开发完全治愈慢性乙肝和降低肝癌发病率的药物。本论文鉴定了参与HBVcccDNA形成的宿主DNA修复系统关键酶多聚二磷酸腺苷核糖基聚合酶1(Poly(ADP-Ribose)Polymerase1，PARP1)并揭示了其调控病毒感染的机制。<br>　　论文引言部分综述了HBV病毒分子生物学及其生活周期，具体介绍HBVrcDNA的结构特征、rcDNA转化为cccDNA的关键步骤以及相关研究的最新进展;同时介绍了PARP1作为DNA修复蛋白的功能以及研究进展，最后总结了目前开展HBV分子生物学研究时使用的感染模型和存在的挑战。<br>　　本研究的主体部分从分子水平、细胞水平以及动物水平研究了宿主DNA修复蛋白PARP1在HBVcccDNA形成过程中的作用。首先，基因敲降和基因敲除的方法减少PARP1在细胞中的表达抑制HBV的病毒复制，证明PARP1参与调控HBV复制。通过病毒进入实验和早时相收样检测，排除了PARP1对HBV病毒颗粒进入细胞以及rcDNA进入细胞核的影响。核质分离实验表明PARP1在病毒感染过程中依然定位在细胞核中发挥功能。接着通过启动子荧光双报告实验进一步排除了PARP1在HBV感染体系中影响转录，最后确定PARP1主要影响HBVcccDNA的形成。<br>　　多种细胞和临床病人样本的检测结果表明，HBV感染会明显促进宿主PAR修饰水平。在进一步的筛选和蛋白质免疫共沉淀实验中我们证明了这种HBV激活的细胞内PAR修饰是由PARP1所介导的。利用PARP1酶活突变体和PARP1抑制剂对此推测进行验证，发现PAPR1酶活突变体E988K则不能恢复HBVcccDNA水平;PARP1抑制剂奥拉帕尼有效抑制Huh7-NTCP细胞，人的原代肝细胞和肝人源化的免疫缺陷小鼠中cccDNA的含量。<br>　　具体而言，细胞核中的cccDNA主要有两个来源，其一是源自入侵细胞的病毒粒子中rcDNA的重头合成途径;其二是以pgRNA为模板逆转录出子代病毒核酸被包裹成核衣壳后，重新进入细胞核完成修复，为细胞内增殖途径。实验结果表明PARP1在HBVcccDNA从头形成过程中发挥作用。而在只有cccDNA细胞内增殖途径的HepAD38细胞中，无论是siPARP1还是奥拉帕尼都对cccDNA没有影响。<br>　　接着，进一步用细胞提取物组成的无细胞系统证明PARP1与HBVDNA之间的相互作用及其在rcDNA转换为cccDNA过程中的作用。首先ChIP实验表明PARP1可能与细胞核中HBVDNA结合，接着DNA-pulldown的实验鉴定出PARP1可识别rcDNA上的两处类损伤位点FLAP和GAP结构。此外，PARP1还可以在体外被纯化的rcDNA激活并促进后者修复成cccDNA。体外合成实验结果表明缺少了PARP1的细胞核提取物无法正常促进cccDNA的合成，PARP1的酶活抑制抑制剂同样也可以在体外体系抑制cccDNA的合成。通过免疫共沉淀的方法证实了在病毒感染过程中，大量的PAR修饰能够结合很多下游的DNA修复蛋白，而PARP1与某些修复蛋白之间的相互作用也十分依赖PAR修饰的介导。<br>　　最后本研究通过蛋白质谱的手段分析病毒感染后与PARP1相互作用增加的蛋白，从而希望揭示PARP1的病毒感染后酶活激活以及蛋白水平降低的原理以及生理意义。综上结果我们的研究运用细胞模型，动物模型以及体外模型发现了HBV感染后，PARP1结合到细胞核中的rcDNA上并且促进其修复形成cccDNA。本研究进一步阐明了DNA修复系统在病毒感染进程中的重要作用，为HBVrcDNA形成cccDNA这一关键分子机制提供新的认识。