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摘要链球菌（Streptococcus）是一类球形的革兰氏阳性细菌，隶属于厚壁菌门，杆菌纲，乳杆菌目，链球菌科，链球菌属。这些细菌细胞分裂时总是沿一个轴，所以通常成对或者链状的。因为这些特征，他们被称作“链球菌”，区别于可以沿多个轴分裂而形成一团细胞的“葡萄球菌”（Staphylococcus）。其广泛存在于环境和人体。链球菌属包含了很多个种，既有对人类有益的菌种也有许多致病菌种。<br>　　有一些链球菌能够引起众多疾病如红眼、脑膜炎、细菌性肺炎、心内膜炎、丹毒、坏死性筋膜炎等，但多数链球菌并非致病菌，而是人体皮肤、口腔、肠道上呼吸道等部位共生菌群的重要组成部分。<br>　　根据链球菌溶血类型进行分类划分，可以将其分为α、β、γ等溶血性链球菌。α溶血性链球菌能够产生过氧化氢，氧化红细胞内血红蛋白分子生成氧化衍生物高铁血红蛋白，在血平板呈现草绿色溶血环;β溶血性链球菌又称完全溶血性链球菌，能够分泌外毒素链球菌溶血素，能够完全裂解红细胞，从而使血平板上呈现浅黄透明溶血环;γ型链球菌不会引起溶血。β溶血性链球菌根据Lancefield分类，即根据细菌细胞壁外荚膜多糖的种类分为不同A-V族（不含I和J型）多个血清型。<br>　　医学上非常重要的致病菌主要是α溶血性链球菌中的肺炎链球菌和草绿色链球菌，以及β溶血性链球菌中的A族和B族链球菌。本论文主要针对A、B族链球菌进行相关研究。<br>　　A族链球菌（GroupAStreptococcus，GAS）又称化脓性链球菌，是一种引起人类高感染率和高死亡率的常见致病菌，主要引起四种类型的疾病:浅表感染如咽扁桃体炎、脓包等;深部感染如坏死性筋膜炎、化脓性关节炎等;毒素介导的疾病如猩红热、毒性休克综合征;免疫介导的疾病如风湿热等。据估算，每年有超过七亿人遭受GAS的感染，导致超过五十万人死亡。在美国每年仅GAS感染造成的儿童咽炎一项就花费约22-54亿美元。<br>　　到目前为止，治疗GAS感染的唯一策略仍然是使用抗生素，但随着抗生素的普遍使用，所引起的细菌耐药性问题愈加严重。细菌不断增强的耐药以及治疗感染所需的高昂花费，使得寻找新的治疗和预防策略，如研发疫苗等，更加迫在眉睫。<br>　　近年来，在抗GAS的新型疫苗研发中，人们发现源自A族链球菌的C5a肽酶(ScpA)是一种比较理想且有良好应用前景的靶标抗原，因为该蛋白不仅存在于多个不同族的链球菌中而且序列保守。据相关文献报道，ScpA是一种多肽酶，其氨基酸Asp130、His193、Ser512以及辅助形成氧离子口袋的Asn295是影响ScpA催化活性的重要氨基酸残基。与野生型相比，这些位点的点突变体蛋白活性有显著降低。研究表明突变体△ScpAD130A,S512A能够激发免疫反应，抑制GAS的侵染。然而，目前对该蛋白突变体的催化活性及其免疫原性的系统性研究尚不完善。<br>　　蛋白载体能够有效提高多糖特异性免疫原性，激发T细胞依赖的免疫应答。目前，被批准应用于多糖-蛋白结合疫苗中的蛋白载体主要包括破伤风毒素(DT)、结核杆菌毒素(TT)、变体破伤风毒素（CRM197）等。蛋白载体既要能激起多糖特异性免疫，又要能有合适的Lys等氨基酸的数量以保证合适载糖量，而且还不能与机体组织交叉反应以免引起自身免疫性疾病，种种限制使得安全有效的蛋白载体种类非常有限。同时，不同疫苗长时间使用相同的蛋白载体，也会引起载体特异性T细胞免疫增强、载体诱导的抗原表位抑制(CIES)等。因此，开发新型蛋白载体具有重要应用价值和现实意义。本文中将对ScpA作为疫苗的靶标抗原和糖缀合疫苗的蛋白载体进行相关的实验研究，为其在疫苗研发方面的应用提供理论支持。<br>　　本实验首先对ScpA的四个单点突变体H193A、D130A、S512A、N295A和一个双点突变体D130A/S512A进行表达和纯化，然后对ScpA及其各突变体的催化活性进行了评估。为此，以未修饰的天然C5a肽作为酶活反应底物，建立了一个简便、高灵敏度的MALDI-TOF质谱检测法来测定酶活的方法。实验结果显示，D130、N295位点突变对酶活的影响不是关键性的;S512位点对酶活比较重要但也并不起决定性的作用;S512单点突变和D130、S512双点突变酶活明显降低，但仍保留部分活性;但是，我们发现H193A单点突变体则完全丧失了催化活性，使该蛋白失去毒力。故而，我们在后续实验中以△ScpAH193A作为疫苗和蛋白载体的研究对象。<br>　　初步的小鼠免疫学实验结果显示，△ScpAH193A具有较高免疫活性，能够引发小鼠免疫应答，激发特异性IgG抗体的产生，这说明该蛋白可以激发T细胞辅助的免疫应答。因此，该蛋白具有发展成为疫苗的潜力。此外，为了研究该蛋白作为一种新型疫苗载体蛋白的潜力，我们将GAS细胞表面多糖抗原的三糖重复单元衍生物共价连接到△ScpAH193A上，并对缀合物进行小鼠免疫实验。试验结果表明，GAS三糖-△ScpAH193A缀合物可以诱导高滴度的三糖特异性抗体IgG1的产生，这揭示了△ScpAH193A作为载体蛋白能够提高寡糖的特异性免疫原性，并激发T细胞依赖的免疫应答。因此，本研究的免疫学实验结果证明△ScpAH193A在设计和开发新型抗GAS疫苗和糖缀合疫苗蛋白载体中具有巨大的发展潜力，并为其提供了一定的实验依据。<br>　　B族链球菌（GroupBStreptococcus，GBS）属于β溶血性革兰氏阳性菌。其表面荚膜多糖(CPs)具有多样的重复单元，并在其黏附、耐干燥、抵抗宿主非特异性和特异性免疫等方面发挥至关重要的作用。根据这些荚膜多糖结构的不同，可以将GBS分为Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ～Ⅸ等十种不同血清型。荚膜多糖位于细菌细胞外表面、具有免疫原性，结构相对保守、变化少、特异性强，具有开发为疫苗的潜力。此外，与传统疫苗相比，荚膜多糖疫苗的成分相对单一，不易引起免疫副反应，更加安全、和便于质量控制。连接蛋白载体后还可以获得多糖-蛋白结合疫苗，增强免疫原性和T细胞介导特异性免疫应答。<br>　　GBS荚膜多糖的合成主要靠一系列合成酶和糖基转移酶催化合成寡糖重复单元，然后外排到细胞膜外，并聚合为多糖大分子。编码这些酶的基因聚集在一起形成基因簇。在多个血清型中，β-1，4-半乳糖基转移酶均催化UDP-Gal+Glcα-PP-Und→Galβ-1，4-Glc-PP-Und反应，该反应在催化荚膜多糖结构单元合成初始步骤中起非常重要的作用。因此，该酶具有重要的应用前景。比如，对其结构的深入研究可以帮助发展酶抑制剂和新型抗菌药物，而该酶也可以作为工具酶运用于相关寡糖和多糖的合成，有助于研究相关多糖的功能和糖疫苗的研发。<br>　　根据序列比对，我们对该酶进行了全基因合成，最终合成的DNA序列共542bp，预期表达产物应当含有177个氨基酸残基。ExPASy预测理论pI和Mw为5.64和20548.17。我们将其在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行表达，纯化得到了高纯度的Cps4G蛋白，经SDS-PAGE电泳发现其分子量为20kDa和40kDa的两条带，进一步经过MALDI-TOF-MS，WesternBlot以及蛋白N末端测序，确定这两条带分别是目的蛋白的单体和二聚体，二者无法完全分离，可以相互转化，且放置随着时间的延长，而二聚体有增多趋势。<br>　　我们分别以D-葡萄糖、4-氨基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷以及N-乙酰-D-氨基葡萄糖等为受体，测定了该酶活性，以期能用做为寡糖和多糖酶法合成的工具酶。然而，实验结果表明该酶具有高度底物特异性，受体Glc-PP-Und的PP-Und的对底物的识别可能起到关键作用。同时，我们还对蛋白进行结晶筛选，发现了适宜蛋白结晶条件，据此条件进行蛋白结晶条件优化，已获得X-ray衍射3(A)结晶，还需要进一步优化，以期获得高分辨率结晶解析该酶的空间结构，从而解释其酶活特性活性关键位点，进一步优化催化活性、底物识别特异性用于开发CPS合成工具酶，并设计酶抑制物进而开发细菌抑制剂。