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摘要纤维素是自然界中丰富的可再生资源，利用纤维素酶降解纤维素，转化获得生物燃料和化工产品，能够保护环境、促进经济可持续发展。在纤维素酶生产菌株中，丝状真菌能够分泌完整的纤维素降解酶组分。探索其纤维素酶合成调控的关键因子，阐明纤维素酶合成的调控网络，将为菌株的遗传改造提供合理的靶点，对于提高酶的产量和降低成本具有重要的现实意义。据报道，假定的甲基转移酶LaeA/LAE1调控丝状真菌发育、纤维素酶基因及次级代谢基因簇的表达。本论文以甲基转移酶LaeA的功能研究为切入点，筛选LaeA互作蛋白，解析了LaeA及其互作蛋白、转录因子共同作用激活草酸青霉纤维素酶基因表达的机制。<br>　　本论文的主要研究结果如下:<br>　　1.草酸青霉LaeA互作蛋白的筛选<br>　　使用酵母双杂交技术(Y2H)和串联亲和纯化(TAP)-质谱(LC-MS/MS)技术筛选并鉴定了细胞内与LaeA具有潜在相互作用的蛋白质。使用酵母双杂交技术，筛选草酸青霉cNDA文库，获得4个LaeA候选互作蛋白，包括异染色质蛋白HepA、羧肽酶、信号转导组氨酸激酶和一个未知功能蛋白。使用串联亲和纯化-质谱技术，筛选鉴定到15个LaeA候选互作蛋白，包括VelB/VeA/LaeA复合物中的成员VeA和VelB、葡萄糖阻遏蛋白TUP1/RcoA、S-腺苷甲硫氨酸合成酶A、组蛋白H2B、硝基还原酶、转录调控因子AmyR、延伸因子EF-2、F1F0-ATPase复合物的亚基、分子伴侣DnaK、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶、1-磷脂酰肌醇-4.5-二磷酸二酯酶、6-磷酸果糖-2-激酶、具有假定的钙离子结合活力蛋白和ATP合成酶的β亚基。根据对已有文献报道结果的分析，我们推测其中6个LaeA候选互作蛋白（分别为异染色质蛋白HepA、VeA、VelB、葡萄糖阻遏蛋白TUP1/RcoA、S-腺苷甲硫氨酸合成酶A和组蛋白H2B）可能参与纤维素酶基因表达的调控。<br>　　2.异染色质蛋白HepA参与染色质凝集，并激活纤维素酶基因表达<br>　　HepA是利用酵母双杂交技术获得的LaeA互作蛋白，为异染色质蛋白HP1的同源蛋白。HepA缺失菌株（△hepA）与野生型菌株和回补菌株相比，产孢能力大幅度降低。回补草酸青霉hepA（RPohepA）或者构巢曲霉hepA（RAnhepA）基因，可以弥补由敲除hepA造成的缺陷，表明构巢曲霉HepA和草酸青霉HepA在生物学功能上高度保守。HepA实际上也是纤维素酶基因表达的激活因子。△hepA菌株发酵四天后，FPA酶活(filterpaperactivity)、CMC酶活(EG，endoglucanase)、pNPC酶活(CBH，cellobiohydrolyase)及pNPG酶活(BG，β-glucosidase)与野生型菌株相比分别下降了65.6％、77.3％、91.8％和70.1％。过表达hepA菌株发酵四天后，FPA酶活、CMC酶活、pNPC酶活和pNPG酶活分别提高了2.5倍、2.9倍、2.2倍和11.9倍。利用实时PCR测定染色质可及性(ChromatinAccessibilitybyReal-TimePCR，CHART-PCR)技术分析了HepA介导的染色质结构的变化，对各突变株的纤维素酶基因上游区域染色质结构的变化进行了分析。△hepA菌株中，两种主要纤维素酶基因cel7A/cbh11和cel7B/eg1的启动子区域（核心启动子区及其上游）的染色质结构发生改变。染色质可及系数(ChromatinAccessibilityIndex，CAI)显著增加，表明HepA是染色质凝聚所必需。<br>　　3.LaeA-RcoA、RcoA-ClrB具有核内的相互作用，且为草酸青霉纤维素酶基因激活表达所必需<br>　　RcoA是利用串联亲和纯化-质谱技术鉴定到的LaeA互作蛋白。实验室前期研究发现，RcoA可与纤维素酶转录激活因子ClrB互作。RcoA通常与Cyc8形成复合物，且在真核生物中高度保守。利用双分子荧光互补(BiFC)技术对RcoA与ClrB、LaeA、Cyc8的相互作用进行确认和亚细胞定位，并对LaeA是否与ClrB、Cyc8具有细胞内的相互作用开展了研究，结果显示:(1)LaeA与RcoA具有相互作用，且发生在细胞核内;(2)ClrB与RcoA具有相互作用，且发生在细胞核内;(3)RcoA与Cyc8具有相互作用，且发生在细胞核内;(4)LaeA与ClrB不具有胞内相互作用;(5)LaeA与Cyc8不具有胞内相互作用;(6)ClrB与Cyc8不具有胞内相互作用。对三个蛋白ClrB、RcoA和LaeA敲除株和过表达菌株的产孢能力及纤维素酶合成能力的分析，发现RcoA和LaeA可调控草酸青霉的发育，而ClrB的敲除和过表达不影响草酸青霉的产孢能力。敲除rcoA可大幅度地降低纤维素酶的合成能力，30℃培养5天后，FPA酶活、CMC酶活、pNPC酶活及pNPG酶活分别降低了86.5％、59.4％、72.0％及57.7％。分别敲除laeA和clrB，主要纤维素酶基因的转录水平及纤维素酶活力均大幅度降低。构建了双突变菌株△laeAOEclrB、OEclrB△rcoA、△clrBOElaeA及△clrBOErcoA。测定纤维素酶酶活，结果显示:30℃培养5天后，△laeAOEclrB菌株与野生型菌株相比，FPA酶活、CMC酶活、pNPC酶活和pNPG酶活分别下降了58.2％、67.9％、64.5％和28.6％;OEclrB△rcoA菌株分别降低了93.5％、88.1％、91.4％和74.2％;△clrBOElaeA菌株分别下降了94.2％、98.2％、72.5％和19.7％;△clrBOErcoA菌株分别下降了95.1％、98.8％、77.7％和13.9％。结果表明，草酸青霉ClrB、RcoA、LaeA均为纤维素酶基因激活表达所必需。<br>　　4.LaeA、RcoA、ClrB激活纤维素酶基因表达的机制研究<br>　　通过串联亲和纯化的方式获取LaeA粗蛋白液，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，催化重组人源组蛋白H2B。LC-MS/MS鉴定分析发现H2BLys109和H2BLys117发生单甲基化。草酸青霉H2B与人源组蛋白H2B相似性达到61.7％，甲基化位点分别对应为草酸青霉H2BLys123和H2BLys131。于是，我们推测，在草酸青霉中，LaeA具有组蛋白甲基转移酶活性，甲基供体为S-腺苷甲硫氨酸，通过甲基化组蛋白H2BLys123和H2BLys131行使功能。为了进一步研究H2B甲基化位点的功能，我们构建了H2B点突变菌株H2BK123A、H2BK131A。结果显示:H2B点突变菌株孢子发育受到严重影响，孢子颜色变浅，且孢子量减少;沉默了菌株多个次级代谢基因簇的表达:并降低了菌株纤维素酶合成能力。同时发现，LaeA，RcoA及ClrB的敲除使得纤维素酶基因cel7A/cbh1和cel7B/eg1的转录水平降低，并伴随着启动子区域的染色质凝聚。在此基础上，我们提出了LaeA、RcoA、ClrB激活纤维素酶基因表达的机制模型:激活转录因子ClrB结合到纤维素酶基因启动子区，招募RcoA-Cyc8复合体，以RcoA为介导招募组蛋白甲基转移酶LaeA，LaeA通过甲基化组蛋白H2BLys123和H2BLys131，改变染色质结构，激活纤维素酶基因的转录。