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摘要植物茎顶端生长点（shootapicalmeristem，SAM）是所有器官形成的来源，其干细胞的维持与分化是器官形态建成的根本。在离体条件下，植物体细胞可通过干细胞功能的获得及干细胞中心(stemcellniche)和生长点的重建不断地再生植株，其中干细胞中心和生长点重建是植株再生的关键，是植物细胞工程的理论基础。WUS（WUSCHEL）和CLV3（CLAVATA3）是调控SAM干细胞维持和分化的关键因子。WUS亦是离体干细胞中心重建的决定因子。迄今，一些调控离体苗再生的功能基因也已被发现，但其数目远远不足，因此开展调控离体苗再生基因的大规模发掘研究具有重要意义。<br>　　植物干细胞和非干细胞的分离及其转录组差异比较研究可有效挖掘调控干细胞维持与分化相关基因。拟南芥SAM中CLV3标志的干细胞仅有15～35个，难以被分离。本研究利用拟南芥pCLV3∷GFP-GUS转基因植株，建立了带CLV3标记的细胞和非标记细胞的转录组图谱，进行了离体干细胞调控关键基因的筛选和验证。细胞分裂素可调控离体苗再生，研究表明A类细胞分裂素响应因子(A-ARRs)抑制离体苗再生，而B类ARRs(ARR1/10/12)通常被认为促进离体苗再生。然而，本实验室前期发现ARR1抑制离体苗再生，为此，本论文开展了不同B类ARRs成员ARR1与ARR12在离体干细胞中心及生长点重建中的相互作用关系及其调控机制的比较研究。外界环境因子——光亦调控离体苗再生，一些光信号途径相关基因（如光形态建成促进因子bZIP类转录因子HY5）参与了离体苗再生，但有关其如何通过调控干细胞关键基因WUS与CLV3来重建离体干细胞中心及生长点的机制尚不清楚。<br>　　本论文利用拟南芥离体干细胞分选、转录组测序及体外培养技术，开展了调控离体生长点重建的功能基因发掘及其作用机制研究，为解析离体苗再生的机理研究奠定了基础。<br>　　主要研究过程和结果包括:<br>　　1、拟南芥离体干细胞调控相关基因的筛选:利用pCLV3∷GFP-GUS胚性愈伤组织悬浮系进行原生质体游离及培养，发现CLV3标记的原生质体可通过细胞分裂形成2细胞、4细胞及胚性细胞团，继而再分化形成再生植株，表明CLV3参与了体细胞胚发生过程，CLV3标记的细胞具有增殖和分化能力，是一类具有干细胞特性的细胞。<br>　　利用流式荧光细胞分选仪，对pCLV3∷GFP-GUS悬浮系游离的原生质体进行了CLV3标记干细胞和非标记细胞的分选，筛选出分选率达到100％的CLV3标记的干细胞和非标记细胞，并对其进行了转录组测序分析，发现二者的差异表达基因数达4259个。与非标记细胞相比，干细胞系中886个基因上调表达，3363个基因下调表达。对差异基因的GO和KEGG富集发现，富集的基因主要参与植物激素信号、光信号、光合磷酸化、氧化磷酸化和核糖体合成等途径。进一步筛选到157个可能参与干细胞维持与分化的候选基因，包括17个与细胞分裂素相关的基因，14个与光信号转导途径相关的基因。利用qRT-PCR分析了部分候选基因在CLV3标记干细胞和非标记细胞中的表达水平，验证了转录组数据的可信度。利用RNA原位杂交，发现候选基因ARR1、ARR12、ARR2、CKX3、CKX7、LOG3、HY5、HYH、PHYA和PHYB在拟南芥SAM干细胞中表达，与CLV3表达部位重叠或部分重叠，表明它们可能参与了干细胞维持与分化。<br>　　利用候选基因的突变体，对ARR1/ARR12和HY5在离体苗再生中的功能进行鉴定，并研究了它们调控离体生长点重建中的作用机制。<br>　　2、ARR1和ARR12调控离体干细胞中心和生长点重建的机制<br>　　为了解析候选基因在离体干细胞中心及生长点重建中的调控机制，利用pCLV3∷mCherry-NLS、pWUS∷mCherry-NLS、pWUS∷sGFP-N、pWUS∷GFP-GU和pCLV3∷GFP-GUS根外植体培养体系，分析了干细胞关键基因WUS及CLV3在离体苗再生中的时空表达模式，结果表明，CLV3表达始于CIM(愈伤组织诱导培养基)2～3d，散布在根中柱鞘及其相邻的愈伤组织中;WUS表达起始于SIM（离体苗诱导培养基）2～3d，分散在中柱鞘外侧2～3层的愈伤组织中;SIM3～4d时，WU和CLV3在愈伤组织中无序地分散表达，未形成特定的位置关系;SIM4～5d时，CLV3与WU共定位于愈伤组织少数细胞中，推测这些细胞为芽祖原细胞(shootpre-progenitors);SIM6～7d时，CLV3信号在一些特定细胞群中聚集，与WU信号共定位，标志着芽祖原分生组织(shootprogenitors)形成，干细胞中心(stemcellniche)的建立;SIM8～9d时，CLV3信号从与WUS共定位的细胞群外移到外侧3层细胞中，WUS信号出现在其下方区域，标志着具有“原体-原套结构”的原生长点(pro-SAM)的形成;SIM10～12d时，原生长点不断发育，从两侧分化出叶原基，标志着成熟的SAM形成，此时，CLV3表达在SAM顶端，WUS表达在干细胞中心。综上，利用WUS和CLV3的表达模式，表征了离体苗再生不同阶段的分子特征。<br>　　对arr1(ARR1缺失突变体)、arr12（ARR12缺失突变体）和arr1arr12(ARR1和ARR12双敲除系)和Col-0进行了离体苗再生能力的鉴定，结果发现与野生型相比，arr1离体苗再生数目增多，arr12再生数目减少，arr1arr12再生能力严重缺失。对WUS和CLV3信号统计发现重建的离体生长点数目顺序亦为:arr1＞Col-0＞arr12＞arr1arr12，表明ARR1抑制、ARR12促进生长点重建和离体苗再生。进一步分析发现，p35S∷ARR1离体苗再生能力小于Col-0，p35S∷ARR1inarr1arr12（p35S∷ARR1载体转入arr1arr12中）离体苗再生能力大于arr1arr12，表明过表达ARR1抑制Col-0离体苗再生能力，而促进arr1arr12的再生能力，从而证实了ARR1抑制离体苗再生的作用依赖于ARR12的存在。<br>　　对ARR1和ARR12的表达模式分析发现，ARR1和ARR12在CIM和SIM上的根外植体愈伤组织中均有较强的表达，但ARR1表达呈现由内向外递减的趋势，而ARR12表达则呈现由内向外递增的趋势，在干细胞中心区表达更强。<br>　　ChIP、LUC实验及植物遗传互补实验表明，ARR12通过直接促进CLV3的表达促进离体干细胞中心重建，ARR1则依赖于ARR12来直接抑制CLV3的表达负调控离体干细胞中心重建。另一方面，ARR1和ARR12均能直接结合WUS启动子上的相同靶序列，ARR1通过与ARR12竞争性结合WUS启动子来减弱ARR12对WUS表达的有效促进作用，最终负调控离体干细胞中心和生长点重建。<br>　　3.HY5调控拟南芥离体干细胞中心和生长点重建的机制<br>　　离体苗再生实验发现，hy5和hy5-215（HY5缺失突变体）根外植体愈伤组织形成和离体苗再生能力强于Col-0，而p35S∷HY5-GFP明显减弱，表明HY5抑制愈伤组织形成和离体苗再生。<br>　　对pHY5∷HY5-GFPinhy5转基因植株根外植体进行GFP信号观察，发现HY5在CIM和SIM培养的整个愈伤组织中强烈表达，推测HY5可能参与了愈伤组织形成和离体苗再生。<br>　　对pCLV3∷GFP-GUS、hy5×pCLV3∷GFP-GU、pWUS∷GFP-GUS和hy5×pWUS∷GFP-GUS根外植体培养物进行GUS活性观察，发现在hy5背景下，WUS表达始于CIM5d的愈伤组织，SIM1d时表达增强，明显早于Col-0背景下WUS的起始时间;SIM2～9d，WUS和CLV3在hy5背景下表达均明显强于Col-0背景下的表达，且WUS和CLV3在芽祖原细胞、干细胞中心和生长点重建期表达均早于Col-0背景下，表明HY5在愈伤组织形成和离体苗再生中抑制WUS和CLV3表达，进而抑制了愈伤组织形成、干细胞中心及生长点重建。<br>　　ChIP、EMSA和LUC实验表明，HY5能直接结合WUS和CLV3的启动子抑制其表达，进而负调控离体干细胞中心及生长点重建。遗传互补实验发现，hy5-215×wus-101的离体苗再生表型与wus-101相同，hy5-215×clv3-7的离体苗再生能力部分恢复到了clv3-7水平，表明HY5在离体苗再生中位于WU和CLV3的上游。<br>　　利用pTCSn∷GFP和hy5×pTCSn∷GFP根外植体进行GFP信号观察，发现pTCSn∷GFP在hy5突变体背景下的GFP强度大于Col-0背景下，表明HY5抑制了根外植体对细胞分裂素的响应。进一步对Col-0和hy5根外植体中B类ARRs表达水平分析发现，ARR12在hy5中表达上调，推测HY5可能通过抑制ARR12表达来抑制离体苗再生。<br>　　ChIP、EMSA和LUC实验表明，HY5通过直接结合ARR12的启动子来抑制其表达，进而负调控离体苗再生。遗传互补实验发现，hy5-215×arr12的离体苗再生表型与arr12相同，hy5-215×arr1arr12的离体苗再生表型与arr1arr12相同，表明HY5在离体苗再生中位于ARR12的上游。<br>　　综上，本研究发掘出调控离体干细胞中心和生长点重建的功能基因ARR1/12和HY5，证明了它们与干细胞关键基因WUS和CLV3的相互作用关系，解析了它们在调控离体苗再生中的分子机制，为全面理解植物细胞全能性机理提供了理论基础。