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摘要研究背景<br>　　鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma，NPC)是一种源自鼻咽上皮细胞的恶性肿瘤，好发于中国南方和东南亚。其病因包括EB病毒感染，遗传易感性和环境因素等。根据NCCN指南，早期鼻咽癌患者接受单纯放疗(RT)，而同期放化疗联合辅助或诱导化疗是局部晚期鼻咽癌患者的标准治疗方案。然而，尽管图像引导等的放疗新技术和新的化疗模式的开展，仍有相当一部分患者对放射抵抗，并最终导致治疗失败。鉴定和治疗放射抵抗的鼻咽癌患者仍是一个亟待解决的临床问题。因此，探究鼻咽癌放射抵抗的分子机制，将有利于探究新的策略来增强鼻咽癌患者的放疗疗效。<br>　　蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)家族在调节肿瘤细胞的功能（例如细胞增殖，粘附和凋亡）中起着至关重要的作用。受体型蛋白质酪氨酸磷酸酶D(PTPRD)属于PTP家族的成员，在多种肿瘤中被认为是抑癌基因。近来研究表明，PTPRD经常通过遗传（纯合子缺失，功能丧失性突变或拷贝数缺失）或表观遗传(miRNA或甲基化）机制，在多种不同类型的人类癌症中表达下调，包括肺癌、胶质母细胞瘤、乳腺癌、黑色素瘤、肝细胞癌以及头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。据报导，PTPRD与CD44和β-catenin/TCF信号传导协同调节结肠癌中的细胞迁移。另一项研究表明，磷酸化的STAT3(p-STAT3)是PTPRD的底物，在乳腺癌中PTPRD表达下调并通过Jak/STAT3信号通路增强其干细胞特性并促进乳腺癌细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化(EMT)。然而，PTPRD在鼻咽癌中的分子功能及潜在分子机制尚不明确。<br>　　研究目的<br>　　1、明确PTPRD在鼻咽癌中的表达情况及调控机制。<br>　　2、明确PTPRD在鼻咽癌中的生物学功能。<br>　　3、明确PTPRD的相互作用蛋白及调控的下游信号通路。<br>　　4、探讨PTPRD通过相互作用蛋白及下游信号通路而发挥生物学作用的分子机制。<br>　　5、分析PTPRD与鼻咽癌患者病理特征及生存预后的相关性。<br>　　研究方法<br>　　1、通过miRNA表达谱芯片数据、甲基化芯片数据及mRNA表达谱芯片联合分析，筛选出被miRNA靶向抑制、启动子区高度甲基化且低表达的基因，qPCR及IHC验证候选基因表达差异性，焦磷酸测序法验证甲基化程度。<br>　　2、用慢病毒载体感染鼻咽癌细胞构建稳定过表达PTPRD的鼻咽癌细胞株（HONE1-PTPRD和HK1-EBV-PTPRD）;用siRNA转染鼻咽癌细胞构建敲低PTPRD的鼻咽癌细胞株（CNE2-siPTPRD和5-8F-siPTPRD）;通过CCK8及克隆形成实验检测PTPRD对鼻咽癌细胞放射敏感性的影响。<br>　　3、通过miRNA芯片数据及生物信息学方法预测直接靶向调控PTPRD的上游miRNA，利用双荧光素酶报告基因实验及qPCR、Westernblot实验进一步确定上游miRNA是否直接靶向调控PTPRD;CCK8及克隆形成实验检测miRNA对PTPRD的调控作用是否影响其生物学功能。<br>　　4、通过文献检索及生物信息学方法预测作为PTPRD去磷酸化作用底物的下游转录因子，利用Westernblot、免疫共沉淀及免疫荧光实验验证PTPRD与下游转录因子的相互作用关系;通过生物信息学方法预测该转录因子调控的下游靶基因，并利用Westernblot、双荧光素酶报告基因实验确定其调控关系;同时在过表达PTPRD的鼻咽癌细胞中重新激活下游转录因子，检测相关表型及基因功能的变化。<br>　　5、体内实验（裸鼠皮下成瘤）验证PTPRD与放射敏感性关系;IHC实验检测皮下瘤组织及临床患者组织中PTPRD与p-STAT3表达相关性;生存分析及单因素/多因素回归分析探索PTPRD及p-STAT3与鼻咽癌患者总生存及无进展生存的关系。<br>　　研究结果<br>　　1、通过对鼻咽癌甲基化芯片(GSE52068)数据、miRNA芯片(GSE42945)数据、mRNA表达谱芯片(GSE12452)联合分析，初步筛选出6个在鼻咽癌中高甲基化且可能被miRNA靶向抑制并且显著低表达的候选基因。在5例鼻咽癌和5例非癌鼻咽新鲜标本中通过qPCR筛选出表达差异最明显的基因PTPRD。在117例鼻咽癌和20例非癌鼻咽石蜡标本验证PTPRD在鼻咽癌中显著低表达。在7例鼻咽癌和7例非癌鼻咽新鲜组织通过焦磷酸测序法验证PTPRD在鼻咽癌中高度甲基化。<br>　　2、为了探究PTPRD在鼻咽癌中的作用，我们通过慢病毒感染HONE1和HK1-EBV细胞构建了稳定过表达PTPRD及对照的细胞株，同时用PTPRD特异性siRNA转染CNE2及5-8F细胞构建了敲低PTPRD及对照细胞株。用qPCR和Westernblot实验验证了表达效率。接着，我们用梯度剂量放射处理鼻咽癌细胞株，通过CCK8和克隆形成实验发现PTPRD促进鼻咽癌细胞的放射敏感性。<br>　　3、miRNA芯片数据挖掘和生物信息学预测结果显示，miR-454-3p与PTPRD基因的3''UTR能很好的匹配。双荧光素酶报告基因实验显示，miR-454-3p直接靶向抑制PTPRD的转录活性。qPCR及Westernblot实验显示过表达或干扰miR-454-3p表达，PTPRD表达水平与其呈负相关。CCK8和克隆形成实验显示，miR-454-3p通过靶向PTPRD调节鼻咽癌细胞的放射敏感性。<br>　　4、基因富集分析结果显示，Jak/STAT3信号通路在PTPRD低表达组中富集。Westernblot实验显示PTPRD表达水平与STAT3磷酸化水平呈负相关;免疫共沉淀实验显示p-STAT3抗体可沉淀Flag-PTPRD蛋白，而Flag抗体可沉淀p-STAT3蛋白;免疫荧光实验显示PTPRD及STAT3在鼻咽癌细胞中存在共定位。结果表明，在鼻咽癌细胞，PTPRD直接靶向p-STAT3并使其发生去磷酸化。<br>　　5、生物信息学预测转录因子STAT3可能靶向自噬相关基因ATG5和BECN1。Westernblot实验发现ATG5表达与STAT3磷酸化水平呈负相关，而BECN1表达水平几乎不受p-STAT3影响。双荧光素酶报告基因实验显示，表明p-STAT3直接与ATG5启动子区的A位点(97～103)和B位点（-335～329）结合，进而抑制其转录活性。<br>　　6、Westernblot实验及免疫荧光实验显示，PTPRD过表达可促进梯度剂量放射处理下鼻咽癌细胞的自噬水平。干扰回复实验显示在过表达PTPRD的基础上，重新激活STAT3磷酸化，ATG5表达下调，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平下调，P62表达上调，放射诱导的自噬表型被部分逆转。<br>　　7、裸鼠皮下成瘤实验显示，PTPRD在体内实验促进鼻咽癌细胞放射敏感性。IHC实验显示裸鼠皮下瘤组织及临床患者组织中PTPRD与p-STAT3表达呈负相关。生存分析显示PTPRD低表达及p-STAT3高表达预示患者总生存及无进展生存不良，二者均可作为预测鼻咽癌患者不良预后的独立预后因素。<br>　　结论<br>　　1、PTPRD在鼻咽癌组织中显著低表达及高甲基化。<br>　　2、PTPRD可促进鼻咽癌细胞的放射敏感性，miR-454-3p可通过靶向抑制PTPRD表达调节鼻咽癌细胞的放射敏感性。<br>　　3、PTPRD通过与p-STAT3结合并使其发生去磷酸化，进而促进ATG5转录和放射诱导的细胞自噬，从而增强鼻咽癌细胞的放射敏感性。<br>　　4、PTPRD在体内实验促进鼻咽癌细胞的放射敏感性，其表达与p-STAT3呈负相关。<br>　　5、PTPRD低表达及STAT3高磷酸化预示患者总生存及无进展生存不良，二者均可作为鼻咽癌患者的独立预后因素。