检索历史 清除

摘要体外合成生物学是合成生物学的重要组成部分。体外合成生物学是将底物，酶，酶复合物和辅酶等加入到一个反应体系中，定向完成底物到目的产物的高效转化。与体内合成生物学和代谢工程相比，体外合成生物学具有转化效率高、反应速率快、产物易分离、对环境就有较高的耐受性、反应条件宽广和易优化等优势。体外合成生物学在能源、大宗化学品、食品和医药等领域具有巨大的应用潜力。<br>　　1本学位论文构建了一种新的乳酸的生产方式，在体外多酶催化系统中能够实现葡萄糖到乳酸的转化。相比于传统的糖酵解途径，该途径仅仅需要五个来源于嗜热菌的酶，不需要添加ATP，能够实现辅酶的循环。<br>　　2通过对整个途径中的所需要的酶的表达纯化和酶活测定，该途径中的所使用的来源于嗜热菌的重组酶均能够在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中很好地表达。<br>　　3通过对途径中所用的酶进行酶活的测定后发现途径中所用二羟酸脱水酶催化甘油酸生成丙酮酸的催化活性太低，仅有0.008U/mg，极大地限制了该途径的应用。<br>　　4在一个1mL反应体系中含有100mmol/L的HEPES缓冲液(pH7.0)，5mmol/LMgCl2，5mmol/LNAD+，1U/mL的葡萄糖脱氢酶，1U/mL的二羟酸脱水酶，1U/mL的2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶，1U/mL的甘油醛脱氢酶，1U/mL的L-乳酸脱氢酶，27.75mmol/L的葡萄糖，在50℃进行催化反应，葡萄糖到乳酸的转化效率较低，反应20小时转化率仅仅为56％。因为在高温条件下葡萄糖能够与氨基酸发生美拉德反应，导致反应体系中的酶失去活性。在初始条件下，该途径中葡萄糖不能被很快的消耗，可能导致酶与葡萄糖发生美拉德反应，使整个体系中的酶失去活性，降低了底物到产物的转化率。<br>　　5为了实现整个途径底物到产物的高效转化，对途径中的酶的添加比例，辅酶浓度和缓冲液浓度进行优化。由优化结果可知，该反应体系的最适条件为200mmol/L的HEPES缓冲液(pH7.0)，5mmol/LMgCl2，5mmol/LNAD+，1U/mL的葡萄糖脱氢酶，2U/mL的二羟酸脱水酶，1U/mL的2-酮-3-脱氧葡萄糖酸醛缩酶，1U/mL的甘油醛脱氢酶，1U/mL的L-乳酸脱氢酶。与初始条件相比，主要提高了缓冲液的浓度和增加了二羟酸脱水酶的添加量。在该条件下，葡萄糖能够很快地被消耗，乳酸的转化率提高至90％。<br>　　本研究表明该途径可以很好地实现葡萄糖到乳酸的转化，并在工业化应用中具有巨大的潜力。