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摘要靶向患者“驱动基因”的个体化治疗已经成为肿瘤治疗的主流趋势并极大推动了抗肿瘤药物的研发进程。非小细胞肺癌是靶基因驱动下个性化精准治疗的经典范例，针对EGFR突变的小分子抑制剂吉非替尼(Gefitinib，Iressa)的成功应用，开启了基于分子分型个体化治疗的全新时代;ALK融合基因是继EGFR基因突变后在非小细胞肺癌中发现的又一具有针对性靶向药物治疗的肿瘤驱动基因，目前已经超过20种分子分型在非小细胞肺癌中得到揭示，相关激酶靶标在包括乳腺癌、肝癌、胃癌、胆管癌等其他多类肿瘤中也是重要的分子分型靶点。长期以来，肿瘤的治疗聚焦于肿瘤细胞本身，忽视了作为功能整体、不可分割的肿瘤微环境。微环境中众多基质细胞，如肿瘤相关巨噬细胞、杀伤性T细胞、MDSC、Treg等，通过与肿瘤细胞互动促进肿瘤进程、介导耐药。事实上，蛋白激酶异常激活不仅是肿瘤细胞自身重要的驱动动力，在促癌微环境形成、肿瘤耐药中也是重要的推动者，引起人们极大的关注，成为抗肿瘤药物研发的新的关注热点。<br>　　本论文聚焦“肿瘤自身”与“肿瘤微环境”重要蛋白激酶靶标分子，构建了肿瘤重要分子分型靶标RET、DDR2、肿瘤微环境肿瘤耐药关键激酶AXL抑制剂评价体系，完成了新型AXL抑制剂DD30123拮抗肿瘤、重塑肿瘤微环境药效特性研究;候选新药SOMCL-15-290靶向RET新敏感群体拓展评价。<br>　　1、新型AXL抑制剂D30123拮抗肿瘤、重塑肿瘤微环境药效特性研究<br>　　AXL在多种肿瘤中高表达异常激活，促进肿瘤细胞存活、运动，血管新生、与微环境成纤维细胞、巨噬细胞等基质细胞交互作用多环节推动肿瘤进程、介导肿瘤耐药，是抗肿瘤药物研发的重要靶标。我们与暨南大学丁克研究员团队合作获得了新型AXL抑制剂D30123。D30123显著抑制AXL激酶酶活，IC50为1.5±0.1nM，抑制效果优于目前临床进展最快的AXL选择性抑制剂BGB324;此外，拓展测试了涵盖AXL同家族激酶、高同源性激酶在内的468种蛋白激酶酶谱分析了D30123作用的选择性，显示D30123整体选择性明显高于BGB324，此外，我们发现D30123显著抑制AML重要的靶标FLT3的酶活，IC50为15.5±4.0nM，与已经通过FDA快速通道的FLT3二代抑制剂AC220作用效果相当，提示了D30123在AML治疗方面的潜力。细胞靶向性研究表明，D30123能够显著靶向抑制细胞中AXL、FLT3通路的活化。基于目前报道的AXL介导的肿瘤细胞增殖体系的局限性，我们拓展扫描了系列肿瘤细胞株，选择了AXL高表达和活化的肿瘤细胞株，发现D30123、BGB324干预和AXL干扰敲除降低AXL的表达，对肿瘤细胞的增殖均无明显影响;而采用AXL融合蛋白驱动的BaF3工具细胞株显示D30123显著抑制AXL驱动的工具细胞株的增殖，提示AXL可能对单一肿瘤细胞的增殖效应影响不大或者目前的肿瘤细胞并不是AXL驱动的体系。D30123也可显著抑制FLT3-ITD突变驱动的肿瘤细胞株的细胞增殖效应，活性与BaF3/TEL-AXL相当，IC50均在纳摩尔级别。对细胞运动表型考察显示，D30123通过靶向AXL显著抑制AXL活化介导的运动，涵盖自身高活化体系、配体GAS6诱导以及TGFβ1/AXL轴线体系。而且，D30123靶向AXL显著抑制VEGF-A诱导的原代内皮细胞的增殖和迁移效应，具有拮抗肿瘤血管新生的作用。进一步拓展肿瘤细胞与微环境基质细胞共培养互动体系，重点关注肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和肿瘤相关成纤维细胞(CAF)，D30123通过靶向阻断GAS6/AXL轴线，抑制TAM、CAF与肿瘤细胞的交互作用，拮抗肿瘤细胞的运动、成纤维细胞的趋化、TAM的趋化以及M2的极化表型。体内采用裸鼠移植瘤和鼠源移植瘤模型研究显示，D30123具有显著的体内抗肿瘤活性、活性优于BGB324，在FLT3依赖的人源白血病细胞MV4-11裸小鼠皮下移植瘤中显示出显著的抗肿瘤效果，D301233mg/kg剂量组抑瘤率达到102.95％，10mg/kg剂量组有3只完全消退。在AXL相关的MDA-MB-231裸鼠实验性转移模型中，10mg/kgD30123可以显著抑制MDA-MB-231的肺转移。在鼠源模型中我们选择了和AXL相关的4T1乳腺癌原位肿瘤模型，考察了肿瘤生长和转移，D30123对肿瘤生长无明显影响，但能够显著抑制4T1的肺转移，活性优于BGB324。进一步对肿瘤组织浸润的基质细胞免疫细胞分析显示D30123给药组，CAF浸润活化减少、肿瘤相关巨噬细胞尤其偏M2型降低，Treg有一定的降低，杀伤性CD8+T细胞浸润活化增多，提示D30123重塑肿瘤微环境拮抗肿瘤的作用，基于免疫抑制性的微环境与免疫治疗耐受尤其是免疫检查点耐药相关，在此基础上，我们进一步考察D30123与经典的免疫检查点anti-PD-1和anti-CTLA4联合用药的效果，D30123确实显著增敏anti-PD-1、anti-CTLA4免疫治疗，抗体单独用药的抑瘤率分别为为33％、38％，相较于单独抗体用药的有效率不足，抗体治疗与D3012310mg/kg联合用药抑瘤率分别为67％、87％，提示D30123通过重塑肿瘤微环境增敏免疫治疗的良好潜力。总之，通过我们的研究明确了D30123靶向AXL/FLT3，拮抗肿瘤、重塑肿瘤微环境药效特性研究。也进一步明确GAS6/AXL在肿瘤以及与肿瘤微环境互动的中重要性和具体调控环节。为后续AXL抑制剂的研发评价提供了重要实验依据。<br>　　2、FGFR/KDR靶向抑制剂SOMCL-15-290靶向RET抗肿瘤活性拓展研究<br>　　SOMCL-15-290是我们团队与上海药物所张翱研究员团队合作研发的FGFR/KDR靶向抑制剂，体内外抗肿瘤活性显著，具有克服FGFR、KDR交互耐药的潜力。同期发现SOMCL-15-290显著抑制RET提示其具有新的用药敏感群体，本论文进行了拓展评价，我们发现SOMCL-15-290显著抑制RET的酶活，IC50为2.8±0.3nM。深入研究表明，SOMCL-15-290在细胞水平能够显著抑制RET基因突变、基因重排的甲状腺癌细胞、肺癌细胞以及Baf3工具细胞株中RET通路的活化。对细胞增殖抑制的结果显示，SOMCL-15-290可显著RET异常激活的肿瘤细胞株和工具细胞株的细胞增殖效应，且IC50均为100nM左右，其增殖抑制效果明显优于甲状腺癌上市药物XL184，而且SOMCL-15-290主要通过诱导细胞发生G1/S期周期阻滞实现细胞增殖抑制作用。体内实验结果显示，SOMCL-15-290在RET异常激活的CDX和PDX模型上均显示了较好的抗肿瘤活性，在人源的甲状腺癌细胞TT的裸小鼠移植瘤模型中，SOMCL-15-290在不同剂量(5，10和20mg/kg)下，剂量依赖性的抑制TT皮下移植瘤的生长，SOMCL-15-290在5mg/kg剂量下的抑瘤率已经超过80％，在10mg/kg剂量下的抑瘤率为98.0％，在10mg/kg剂量下，肿瘤产生消退，对移植瘤组织显示，给药后可以显著抑制RET通路的活化。在具有CCDC6-RET融合基因的结肠癌PDX模型中，SOMCL-15-290在5mg/kg、20mg/kg剂量下可以显著抑制肿瘤的生长，抑瘤率，在所测试剂量下，小鼠体重均无明显降低，提示SOMCL-15-290良好的耐受性。总之，SOMCL-15-290通过靶向RET，具有显著的体内外抗肿瘤活性，通过我们的研究有效的拓展SOMCL-15-290靶向RET的新敏感群体，提示其在RET突变或重排肿瘤治疗中的潜力。