摘要植物激素是存在于植物体内的天然有机小分子化合物,在调节植物生长发育和应对外界胁迫的过程中发挥着重要作用。根据结构特征和生理作用的不同,植物激素被划分为不同的种类,各类植物激素通过拮抗或协同等复杂的相互作用形成了植物激素调控网络。为了清晰地阐明植物激素网络调控的机理和作用,植物学家们需要更加灵敏高效的分析技术,能够在同一份植物样品中稳定可靠的同时分析各类植物激素的含量。目前多种植物激素同时定量技术的研究虽然取得了一定的进展,但已建立的方法存在灵敏度低、可同时定量的植物激素种类不全面等问题,尤其是不能同时定量近年来备受关注但含量相对更低的独脚金内酯和油菜素内酯类植物激素,成为了植物激素调控网络研究的一个技术瓶颈,因此亟需建立更加全面、更加灵敏的多种植物激素同时定量的分析方法。<br> 针对上述问题,本研究选取了独脚金内酯、油菜素内酯、赤霉素、生长素、脱落酸、茉莉酸、水杨酸、细胞分裂素、乙烯以及多肽类等十大类植物激素为研究对象,设计了基于混合模式离子交换固相萃取柱串联富集纯化的策略,结合超高效液相色谱串联质谱联用技术(UPLC-MS/MS)以及差分离子淌度(Differentialmobilityspectrometry,DMS)分离技术,建立了高灵敏度、高通量的多种植物激素同时定量的分析方法,可为植物激素调控网络研究提供更加全面的信息,从而为植物激素互作机理的深入研究奠定必要的技术基础。主要内容如下:<br> 1.根据十类植物激素的物理化学性质,设计并建立了反相离子交换混合模式串联的多维固相萃取纯化方法,能够对不同种类的植物激素实现针对性的富集纯化。我们优化了固相萃取的上样、淋洗和洗脱等条件,最后结合UPLC-MS/MS检测技术,建立了高效、高灵敏的多种植物激素同时定量的分析方法。该方法有效地解决了现有已知所有种类的植物激素同时定量的分析难题,覆盖植物激素化合物达44个;同时,简化了前处理步骤,缩短了前处理时间;有效提高了方法的通量。该方法达到了很好的除杂效果,基质效应在62%~103%之间;回收率在50%~100%之间;重现性良好(RSD<12%),检出限和定量限分别在0.02~1.99pg和0.24~6.62pg之间,说明该方法具有很高的灵敏度。方法可适用于水稻和拟南芥等模式植物的各个组织部位,利用该方法对各种遗传背景的野生型或突变体的水稻及拟南芥样品进行了多种内源植物激素的同时定量分析,结果均符合其遗传背景,与文献报道一致。<br> 2.为了进一步提高检测方法的灵敏度,我们在UPLC-MS/MS联用技术的基础上,于质谱前端引入了DMS分离技术,从而在质谱分析之前实现了正交二维分离。实验通过优化补偿电压、分离电压、DMS温度以及化学修饰剂等与DMS相关的参数,建立了可同时检测赤霉素、生长素、水杨酸、脱落酸和茉莉酸等多种酸性植物激素的UPLC-DMS-MS/MS检测方法。因为显著降低了背景噪音,植物激素分析检测的灵敏度得到了进一步的提高,所以能检测到常规UPLC-MS/MS方法检测不到或因为受到干扰无法定量的化合物,特别是在赤霉素类植物激素分析中效果尤为显著,可在100mg植物样品中同时定量16种赤霉素类化合物。
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