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摘要维生素B12（钴胺素）是参与高等动物和人体生理代谢的一种必需维生素并且被广泛的应用到医疗健康、食品和饲料等领域。维生素B12的国内外市场需求不断增加，限于化学全合成繁琐的步骤和高昂的成本，目前工业上只能通过微生物发酵获得。脱氮假单胞菌是重要的维生素B12工业生产菌株，目前缺乏一种简便高效的技术用于其代谢研究。CRISPR/dCas9技术的发展为脱氮假单胞菌的改造提供了技术支持。<br>　　在本论文中，基于CRISPR/dCas9技术在脱氮假单胞菌中构建了一套简单高效的基因弱化系统，通过质粒pDS共表达dCas9和特定sgRNA实现对目标基因的特异性弱化。为了使得CRISPR/dCas9系统对脱氮假单胞菌基因表达的抑制具有可诱导性，选择氨基乙磺酸诱导型启动子控制dCas9基因的表达。通过优化引物设计，使得弱化质粒的构建十分简便。接着利用CRISPR/dCas9系统，对绿色荧光蛋白gfp报告基因的弱化效率进行探究，证实该系统能有效地抑制目标基因的表达，且同一基因中不同靶点位置对于基因抑制的效果不同。利用CRISPR/dCas9系统对脱氮假单胞菌内源基因cobB进行弱化效率探究，证实该系统能有效抑制cobB基因的表达，且同时表达多个打靶cobB基因的sgRNA能提高目的基因弱化的效率。通过对phbAB操纵子的弱化，发现该系统能根据靶点位置的选择有效地用于全部或部分操纵子基因的弱化。利用CRISPR/dCas9对其代谢通路进行有效改造，通过血红素代谢途径基因和聚羟基丁酸代谢中相关基因的弱化，最终得到PDA302/pDS-hemE-hemF-phbC弱化菌株，证实表达多个打靶不同基因的sgRNA，可以实现多个基因的同时弱化。经250mL摇瓶发酵验证，发酵144h后弱化菌株的维生素B12产量达到(104.81±2.54mg/L)比对照菌PDA302/pDS-None(81.92±2.85mg/L)提高了27.9％。<br>　　CRISPR/dCas9系统在构建难易程度和效率上有着显著的优势，为脱氮假单胞菌中维生素B12的代谢研究开辟了一条新的途径。这种简便高效的选择性基因弱化技术也将促进细胞工厂的发展和高附加值生化产品的生产。