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摘要随着现代社会的快速发展，抑郁症的发病率逐年上升。从流行病学角度上，抑郁症存在高发病率、高自杀率和高复发率的“三高”现象，给患者及其家属带来了巨大的痛苦和负担。现有临床药物存在治愈率低，起效缓慢、个体差异大和副作用等问题，因此亟需寻找抗抑郁药物的新靶标和新机制。最近的研究表明，作为双孔钾通道(K2P)家族成员之一，TREK-1钾通道与抑郁症、情绪障碍和神经保护等密切有关，且基因敲除实验表明TREK-1通道基因敲除小鼠表现出抗抑郁的表型。临床抑郁症患者的基因多态性与TREK-1基因相关，多种临床一线抗抑郁药物也能直接抑制TREK-1钾通道。因此，TREK-1钾通道可能是抗抑郁症的潜在新靶标，筛选和发现TREK-1钾通道的高效抑制剂是抗抑郁药物研发的重要方向之一。<br>　　根据晶体结构的报道，K2P通道区别于其他钾通道的一个显著特征是在选择性滤器“selectivefilter”外面有一个胞外“帽子”结构域，并且该结构域使得K2P通道对一般的钾通道抑制剂(如TEA)不敏感。以往的大量文献表明TREK家族通道的选择性滤器”是门控位点之一，另一方面其跨膜区域对于调控通道的活性也很重要。基于上述背景，本论文的主要科学问题是:筛选和发现新型的TREK-1通道抑制剂，验证TREK-1通道的新调控区域和位点，并进一步阐明调控TREK-1的新机制。通过多次计算机动态模拟，我们发现除了TREK-1的“选择过滤器(selectivityfilter)”周围的“窗口”区，在胞外的帽子“Cap”区和跨膜区靠近胞内侧的M2-M4之间，都有可能存在调节剂的结合位点。针对TREK-1通道胞外的帽子“Cap”区和靠近胞内侧的M2-M4之间的两个潜在结合位点，我们做了以下研究:<br>　　首先针对TREK-1通道胞外的帽子“Cap”区，通过理论计算发现在TREK-1通道的胞外结构域(Cap区)中存在动态空腔，是一个潜在的小分子结合位点。通过开展靶向该动态空腔的药物设计及大量化合物筛选，获得了TREK-1通道新的小分子抑制剂TKDC。然后通过inside-out、outside-out、全细胞膜片钳、定点突变和计算机模拟等实验，我们进一步确证了新发现的活性化合物与新位点结合的构效关系。这一部分的研究结果表明TREK-1通道的胞外的“Cap”区是抑制剂的重要结合位点。在本论文第二部分研究中，针对TREK-1通道的跨膜区域，利用分子动力学(MD)模拟，我们发现TREK-1通道由“Down”状态转变成“Up”状态的过程中，存在中间态构象。计算机模拟结果预测在跨膜区域TREK-1通道有两个潜在的抑制剂结合位点。位点一在TREK-1通道的M4螺旋与另一个亚基的M2螺旋之间，位点二在跨膜螺旋M2，M3，M4的胞内侧螺旋之间。其中TREK-2/氟西汀的晶体复合物已经证实位点一的存在。我们通过对化合物的筛选和检测，发现了结合于位点二的小分子抑制剂。基于计算模拟的结果和新发现的活性抑制剂，我们开展了针对位点二(胞内侧螺旋M2-M4之间)的构效关系研究，并且发现小分子通过稳定中间态构象起到抑制通道的作用。新位点的发现为TREK-1通道的抑制剂设计提供了新方法，对于理解TREK-1通道的激活与关闭过程也具有重要意义。我们进一步通过抗抑郁的动物行为药效试验，结果表明新发现的TREK-1抑制剂TKDC具有较好的抗抑郁样行为，且起效剂量和起效时间优于阳性对照氟西汀。因此，TREK-1通道可能是发现快速抗抑郁药物的重要靶点。<br>　　综上所述，以往的研究报道提示TREK-1钾通道可能是抗抑郁的潜在新靶标，但是尚缺乏特异性TREK-1钾通道的调节剂。我们综合计算机模拟、结构分析和功能实验，发现了位于胞外侧帽子区和跨膜区的两类结合位点，并且获得了一系列高效高选择性的TREK-1抑制剂，进一步通过动物行为学药效实验，获得了抗抑郁的先导化合物。我们的研究工作初步阐明了靶向TREK-1的新位点和调控机制，为抗抑郁的新药研发提供了新的研发策略和先导化合物。