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摘要卵巢癌是死亡率最高的妇科肿瘤，其一线治疗方法是手术辅以铂类药物为基础的联合化疗。然而，在多次反复治疗的过程中，多数患者对铂药的敏感性会逐渐下降。顺铂(CDDP)是最经典的铂类药物，其抗性涉及药物的摄取及排出，巯基类物质的解毒、DNA的修复增强和特定细胞信号通路的异常等机制。谷氨酰胺代谢重排是肿瘤代谢重编程的重要特征，它不仅通过回补三羧酸循环促进能量的产生、为谷胱甘肽和核酸等的合成提供原料，还可对细胞内特定信号通路起调节作用。研究表明，阻断谷氨酰胺代谢可以抑制肿瘤的生长，并对顺铂起增敏作用，是通过打破细胞内的氧化还原平衡实现，然而更全面、深入的作用机制未被探讨。<br>　　联合治疗的给药方式对药物能否发挥最佳疗效具有重要作用。纳米医学技术下的双药共递送是目前较为理想的联合给药策略。环境响应型脂质体具有生物相容性高、生物可降解，可同时担载溶解度不同的多种药物，响应肿瘤微环境释放药物，达到增加药物疗效而不累积毒性，延缓耐药性等多种目的，具有十分广阔的应用前景。<br>　　目的和意义<br>　　基于目前临床顺铂治疗存在的问题和谷氨酰胺酶抑制剂在抗肿瘤和增敏铂药方面的优势，本文拟将顺铂和谷氨酰胺酶抑制剂BPTES共载于智能氧化响应型脂质体中，以期通过高通透及滞留(EPR)效应使药物被动靶向于肿瘤部位，响应肿瘤氧化环境释放药物，达到饥饿治疗协同化疗并增敏顺铂的效果。本研究对于提高卵巢癌的治疗疗效，改善卵巢癌患者低生存率的难题，具有重要的理论意义和应用价值。<br>　　方法<br>　　(1)以DOPC、胆固醇和DSPE-mPEG2000为原料，采用薄膜分散法分别制备单载CDDP和共载CDDP与BPTES的脂质体(CDDPLPs和C@BLPs)，采用电感耦合等离子光谱发生仪(ICP)和高效液相色谱法(HPLC)分别建立CDDP和BPTES含量测定的方法，计算CDDP和BPTES的包封率;采用X射线光电子能谱(XPS)表征脂质体中的元素组成，采用动态激光光散射法(DLS)测定脂质体的粒径、分散系数(PDI)和Zeta电位;采用透射电子显微镜(TEM)观察脂质体的形貌;通过测定在含血清环境下的脂质体粒径及分散系数变化考察脂质体的稳定性;最后，通过DLS检测、TEM观察和透析法评估脂质体响应氧化环境裂解并释放药物的能力。<br>　　(2)采用MTT和流式细胞术考察CDDPLPs和C@BLPs的体外细胞毒性，计算CDDP和BPTES的协同指数;通过内吞实验，内吞机制研究、铂摄取实验，GLS活性、代谢物检测、GSH和ATP检测以及Westernblot等多种方法从药物的摄取、排出和解毒，DNA的修复以及特定信号通路的异常等多个方面探讨C@BLPs中BPTES增加顺铂毒性的作用机制。<br>　　(3)建立荷瘤小鼠模型，采用尾静脉给药，通过小动物荧光成像和ICP检测研究脂质体的体内生物分布，通过绘制肿瘤生长和小鼠体重变化曲线、血清生化检测、HE染色、TUNEL染色等进行C@BLPs的药效和毒副作用评价，通过对肿瘤组织进行GSH检测、免疫组化和液质联用(LC-MS)非靶向代谢组学分析，探讨C@BLPs的体内抗肿瘤机制。<br>　　结果<br>　　(1)通过薄膜分散法成功制备了CDDPLPs和C@BLPs两种脂质体;XPS和HPLC显示两种药物成功包封进C@BLPs中，CDDPLPs的CDDP包封率为80.3±2.6％，而C@BLPs的CDDP包封率为18.7±0.9％，BPTES包封率为17.8±1.2％，CDDP和BPTES的摩尔比为1∶1.4;TEM观察CDDPLPs和C@BLPs呈球形，分布均匀;DLS检测两者的粒径分别为138.70±0.92nm和156.33±17.40nm，PDI均小于0.3，Zeta电位均为负，且绝对值大于30;连续7天测试处于含血清溶液中的CDDPLPs和C@BLPs的稳定性，发现7天内脂质体的粒径较为稳定，平均PDI在0.3以下;TEM、DLS和透析法考察发现脂质体在H2O2溶液中孵育会出现裂解，24小时Pt释放累积超过80％，BPTES的释放累积超过65％，而在PBS溶液中Pt释放不到40％，BPTES释放不到30％。<br>　　(2)MTT结果显示，对于SKOV3细胞，CDDP、CDDPLPs和C@BLPs的IC50分别为11.84±1.51μM、9.00±0.94μM和3.34±0.15μM，而对于SKOV3DDP细胞，分别为84.34±4.27μM、66.95±6.64μM、9.26±1.07μM，三组之间两两比较均有显著性差异;在脂质体载CDDP与BPTES为1∶1.4的摩尔比下，两种药物起协同作用;细胞内吞及其机制研究发现，脂质体通过胞饮进入SKOV3DDP细胞，并呈时间依赖性;相比CDDP，CDDPLPs促进SKOV3DDP细胞的Pt吸收，联合BPTES递送还可进一步增加细胞内的Pt蓄积量;另外，BPTES和C@BLPs可显著降低SKOV3DDP细胞的GLS活性，造成谷氨酰胺的积累，导致谷氨酸，α-酮戊二酸、草酰乙酸和天冬氨酸的减少，同时抑制GSH和ATP的生成，其抑制作用具有浓度依赖性;Westernblot实验提示，C@BLPs可导致SKOV3DDP细胞的γ-H2AX、Bax和Caspase-3表达显著上升，而mTOR和Bcl-2表达显著下降。<br>　　(3)药物体内分布实验显示所制备脂质体的体内循环时间超过24小时，CDDPLPs和C@BLPs可富集并滞留于SKOV3细胞荷瘤小鼠的肿瘤部位，可显著提高肿瘤组织的Pt蓄积量;体内药效和毒性研究发现，C@BLPs具有良好的体内抗肿瘤作用，可显著降低CDDP的肝肾毒性，但无法完全消除;另外，相比CDDPLPs，加载BPTES的C@BLPs未加重其体内副作用;肿瘤组织的免疫组化实验显示CDDP、CDDPLPs和C@BLPs均导致肿瘤组织的γ-H2AX和CleavedCaspase-3表达升高;C@BLPs还可显著降低肿瘤局部的GSH水平;LC-MS非靶向代谢组学结果提示C@BLPs治疗导致肿瘤中多种代谢物水平产生显著改变，同时，一系列的代谢途径受到影响，如甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺代谢、TCA循环、ABC转运体、蛋白质消化和吸收等。<br>　　结论<br>　　(1)本研究成功制备了CDDPLPs和C@BLPs，均粒径适宜，分散均匀，在生理介质中稳定性良好，能响应氧化环境裂解并释放药物。<br>　　(2)对于SKOV3和SKOV3DDP细胞，CDDPLPs和C@BLPs显著增加细胞对CDDP的敏感性，其中C@BLPs的增敏作用更强;C@BLPs增加SKOV3DDP对顺铂的敏感性可能是以下几种机制的综合作用:1)以脂质体递送绕开CDDP的摄取屏障;2)抑制GSH合成来减少CDDP的解毒;3)减少ATP生成来抑制ATP依赖的转运泵对CDDP的外排;4)通过减少天冬氨酸合成影响核苷酸代谢进而促抑制DNA损伤修复;5)通过减少α-酮戊二酸抑制mTOR通路，促进Caspase-3介导的凋亡信号。<br>　　(3)C@BLPs具有体内长循环功能，可通过EPR效应被动富集并滞留于SKOV3细胞荷瘤小鼠的肿瘤部位，显著提高肿瘤组织的CDDP蓄积量;C@BLPs具有良好的体内抗肿瘤作用，可显著降低CDDP的系统毒性，但无法完全消除;C@BLPs在体内通过扰乱肿瘤组织代谢、降低肿瘤局部GSH、损伤细胞DNA，诱导细胞程序性死亡来起杀伤作用。