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摘要正常情况下，机体的免疫系统能够监视、清除病变的细胞。但是，肿瘤仍然能够继续生长进而影响到生活质量及生命安全，说明肿瘤本身存在一定的机制来逃逸机体的免疫监视。近年来研究发现:肿瘤通过抑制性协同共刺激分子拮抗T细胞抗肿瘤效应是肿瘤免疫逃逸的重要机制，阻断这类分子成为肿瘤免疫治疗研究新的热点。PD-1(Programmeddeath1)及其配体PD-L1(Programmeddeath-ligand1)属于CD28/B7超家族蛋白，可截断T细胞活化信号，抑制T细胞增殖及细胞因子的释放，在肿瘤免疫逃逸、自身免疫性疾病及病毒感染过程中发挥重要作用。目前，以“阻断PD-1/PD-L1信号通路”发挥作用的抗PD-1抗体nivolumab和pembrolizumab已被FDA批准用于肿瘤临床治疗。同时研究发现:可溶性PD-1(soublePD-1，sPD-1)能够封闭膜结合性PD-1和PD-L1的相互作用，增强T细胞抗肿瘤功能。因此，本课题设想通过分子定向进化及噬菌体高通量筛选相结合的方法筛选高亲和PD-1突变体（可溶性形式），更有效的阻断膜结合性PD-1/PD-L1的相互作用，解除T细胞在肿瘤微环境中受抑制的状态，增强抗肿瘤能力，从而开发一种新型的PD-1/PD-L1阻断分子。<br>　　本研究中，我们通过分析mousePD-1/humanPD-L1(mPD-1/hPD-L1)的晶体结构及hPD-1的晶体结构选择了hPD-1中24个氨基酸作为潜在的可优化位点，通过分子定向进化的原理构建了5个突变文库，经噬菌体高通量筛选，得到一系列亲和力提高的PD-1突变体（2-3000倍）。其中亲和力提升最高的PD-1突变体被命名为L5B7，其与PD-L1结合的亲和力相对野生型PD-1提高了3000倍。流式细胞术分析野生型PD-1及L5B7蛋白对H1299细胞表面PD-L1的识别情况，发现随着加入的蛋白浓度从0.02mg/ml到0.08mg/ml逐渐增加，野生型PD-1及L5B7识别肿瘤细胞表面PD-L1的能力均逐渐增强，但相同浓度下L5B7识别PD-L1的能力远大于野生型（当浓度为0.02mg/ml时，L5B7识别PD-L1的阳性率为79.5％，而PD-1的仅为2.1％）。使用真核表达系统表达PD-1-IgG4、L5B7-IgG4融合蛋白，在细胞水平也证明了L5B7-IgG4融合蛋白能够促进ImmTAC-IG4介导的PBMC(Peripheralbloodmononuclearcell)对Me1624肿瘤细胞系的杀伤作用，并比PD-1-IgG4作用显著。这证明了高亲和性PD-1蛋白作为新型的PD-1/PD-L1信号通路的可行性，为后续进一步应用奠定了基础。