假体周围感染临床特征与紫草素抗MSSA生物膜粘附机制的研究-论文-万方医学网

假体周围感染临床特征与紫草素抗MSSA生物膜粘附机制的研究

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摘要目的: 　　1.临床特征研究通过临床病例回顾，探析假体周围感染(PJI)临床菌株分布特点、药敏特点，优化临床诊断、治疗PJI方案，并为实验选择药物、选择病原菌提供依据。 　　2.在体外细胞实验中，明确紫草素在生物膜形成粘附期对形成MSSA生物膜的抑制作用。 　　3.从分子生物学角度阐明紫草素抑制MSSA生物膜的形成与FnbpA、SarA、SigmaB、SPA、icaA、icaD粘附基因的作用关系，进一步深入探讨紫草素抑制MSSA生物膜形成的分子作用机制。 　　4.在体内动物实验中，验证紫草素对小鼠膝关节MSSA假体感染模型具有治疗作用。 　　方法: 　　1.临床研究 　　纳入符合标准因PJI行人工关节二期翻修的临床病例77例，计算出所有病例资料菌株种类、各种菌株占比、髋膝分布，并计算出主要革兰氏阴性菌株和革兰氏阳性菌株对各种抗菌药物的耐药株、耐药率、敏感株、敏感率。 　　2.体外细胞研究 　　(1)紫草素、庆大霉素对MSSA的MIC及MBC的测定。 　　(2)联合药敏试验用以检测紫草素与庆大霉素联合抗菌效果。 　　(3)生长曲线用以检测不同浓度紫草素对MSSA活性的影响。 　　(4)结晶紫半定量粘附试验用于测定不同浓度紫草素对MSSA生物膜形成的影响。 　　(5)活菌计数法用以测定紫草素干预后MSSA生物膜的形成量。 　　(6)扫描电镜观察紫草素对钛金属块表面MSSA生物膜的形态方面的影响。 　　3.分子机制研究 　　将金黄色葡萄球菌ATCC186335(MSSA)作为研究对象，选取粘附相关基因进行筛查，采用实时定量PCR技术对FnbpA、SarA、SigmaB、SPA、icaA、icaD等6个具有明显差异表达的基因进行验证，进一步阐明紫草素抑制MSSA生物膜形成的分子作用机制。 　　4.体内动物实验研究 　　选SPF级C57BL/6小鼠，共18只，随机分成A、B、C三组，每组6只，其中A组（实验组）:在小鼠膝关节胫骨侧留置假体并注入细菌、紫草素;B组（感染组）:在小鼠膝关节胫骨侧留置假体并注射细菌、磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffersaline，PBS);C组（空白组）:在小鼠膝关节胫骨侧留置假体，不注入菌、药，只注入PBS。观察对比三组小鼠的一般情况、大体标本情况、血液指标、Micro-CT影像学、组织病理切片、扫描电镜下生物膜。 　　结果: 　　1.临床研究 　　纳入77例中检出菌株阳性51例(66.33％)，其中膝22例、髋29例;检出菌株阴性26例(33.77％)，其中膝9例、髋17例。菌株阳性中革兰氏阳性菌株43例(55.84％)、革兰氏阴性菌株6例(7.79％)、真菌2例(2.60％)。革兰氏阳性菌种有11种，金黄色葡萄球菌(MSSA)最为多见、13例(16.88％);其次为金黄色葡萄球菌(MRSA)和表皮葡萄球菌。革兰氏阴性菌种有4种，最多见的是肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌。真菌有两种，分别为拟平滑假丝酵母菌和热带假丝酵母菌。 　　培养出的3种主要革兰氏阳性菌（包括MSSA、MRSA、表皮葡萄球菌）对青霉素耐药率都很高，分别为84.62％、85.71％、100.00％;对万古霉素、利奈唑胺、达福普汀、替加环素敏感率非常高，敏感率均为100.00％。培养出主要的革兰氏阴性菌为肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌。肺炎克雷伯菌对环丙沙星、庆大霉素、呋喃妥因、氨苄西林、头孢唑林、氨曲南的耐药率为100.00％;对头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、阿米卡星、厄他培南等未发现耐药，敏感率为100.00％。培养出的两种真菌均对两性霉素B、氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、5-氟胞嘧啶敏感。 　　2.体外细胞研究 　　(1)紫草素、庆大霉素对金黄色葡萄球菌的MIC分别为100μg/mL、0.156μg/mL。紫草素、庆大霉素对金黄色葡萄球菌的MBC分别为400μg/mL、0.156μg/mL。 　　(2)紫草素与庆大霉素联合药敏试验结果:FIC指数=1/2+1/2=1，又因0.5＜FIC指数≤1，为相加作用。 　　(3)不同浓度紫草素对MSSA活性的影响的生长曲线呈浓度依赖性。 　　(4)结晶紫半定量粘附试验中随着紫草素浓度升高，结晶紫染色颜色变淡，金黄色葡萄球菌生物膜光密度（opticaldensity，OD）值减少，各浓度与0MIC比较P＜0.05，差异呈显著性;当紫草素浓度达到2MIC时，生物膜量急剧减少，与0MIC组比较P＜0.05，生物膜形成量减少10倍。 　　(5)活菌计数显示不同浓度紫草素直接干预菌液，无论在钛金属块表面生物膜形成早期（粘附期）还是在后期（成熟期），紫草素对生物膜的形成均呈抑制作用。但是在粘附期的抑制作用强于成熟期。直接干预6小时、直接干预24小时、成膜干预24小时、成膜干预4小时0MIC与1/2MIC比值分别为57倍、4.2倍、4.02倍、1.56倍。 　　(6)扫描电镜结果说明紫草素在生物膜粘附期(培养4～6h)、生物膜成熟期(培养24h)对生物膜的形成均呈抑制作用，但在粘附期抑制作用更强。 　　3.分子机制研究 　　紫草素浓度依耐性的降低对MSSA菌株生物膜粘附相关基因mRNA的合成有着显著的影响。 　　4.体内动物实验研究 　　观察实验小鼠的一般情况、大体标本情况、Micro-CT影像学、组织病理切片、扫描电镜下生物膜等方面，结果见紫草素对小鼠膝关节假体术后感染治疗有效。 　　结论: 　　1.临床研究 　　PJI患者的主要致病微生物为革兰氏阳性葡萄球菌，其中金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性表皮葡萄球菌最为常见。影响抗生素的耐药性因素有很多，不同的临床菌株对抗生素的耐药率、敏感率不同，所以在选择抗生素前应该通过药敏试验后再予以使用，根据药敏结果选取合适的抗生素进行治疗。 　　2.体外细胞研究 　　(1)紫草素、庆大霉素对金黄色葡萄球菌均具有抑菌、杀菌作用。 　　(2)紫草素与庆大霉素联合抗MSSA有相加效果。 　　(3)紫草素对MSSA有明显的抑制作用，且紫草素的抑菌作用随着浓度的增加而加强。 　　(4)结晶紫半定量粘附试验得出紫草素可以抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成，要取得最佳、最显著的效果，浓度在2MIC以上。 　　(5)紫草素对生物膜的抑制作用在生物膜形成早期（粘附期）最强最明显，紫草素在粘附期起主要抑制作用。 　　(6)扫描电镜结果说明紫草素在粘附期对生物膜抑制作用更强。 　　3.分子机制研究 　　紫草素通过影响icaA、icaD、SPA、PnbpA、sigmaB和SarA这些粘附相关基因来抑制MSSA生物膜的形成。紫草素对MSSA生物膜形成的抑制是通过两条粘附路径完成的。 　　4.体内动物实验研究 　　紫草素在小鼠膝关节假体置换术后具有良好的抗菌、抗生物膜作用，紫草素对小鼠PJI具有良好的治疗效果。