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摘要B细胞淋巴瘤是来源于淋巴组织的恶性增殖性疾病，严重威胁人类的健康。研究发现，B淋巴细胞表面抗原B1(B lymphocyte surface antigen B1,CD20)在超过95％的B细胞淋巴瘤中表现出异常的高表达，在造血干细胞、浆细胞和其他正常组织中不表达。同时，CD20不会从B细胞上脱落，与抗体结合后无显著内化，是治疗淋巴瘤的良好靶点。然而，传统单抗药物由于其穿透力较差严重影响其疗效。此外，由于B细胞淋巴瘤具有极强的异质性，30％-40％的患者无法通过传统的化疗联合免疫治疗获益。软骨鱼来源的单域抗体分子量可小至12 kDa,穿透力强，是目前已知的动物界中可有效靶向目的抗原的最小分子，是极具潜力的淋巴瘤治疗候选药物。<br>　　目的:<br>　　本研究通过采用CD20免疫条纹斑竹鲨，使其产生特异性针对CD20的单域抗体，利用噬菌体展示技术筛选单域抗体，进行序列测定，并评价重组单域抗体的体外生物学活性，为淋巴瘤的靶向治疗提供一个新的思路与实验基础。<br>　　方法:<br>　　通过分析人CD20序列，选取胞外大环区原核表达，进行抗原的制备。通过分析VNAR抗体序列，找出其中高度保守片段，选择合适的抗原表位并进行多肽合成，免疫新西兰大白兔制备抗VNAR血清检测抗体。使用CD20蛋白免疫条纹斑竹鲨，免疫过程中取血，并用血清检测抗体进行免疫效果评价。免疫六次后处死鲨鱼，取脾脏用于转录组文库的构建和噬菌体文库的构建。将转录组测序结果与对照组比较，进一步分析免疫效果。通过噬菌体展示技术，筛选出特异性针对CD20的单域抗体。<br>　　将筛选获得的VNAR基因碱基序列经密码子优化后，克隆至原核表达载体pET-41b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，筛选工程菌并大量表达纯化，获得重组单域抗体。ELISA检测重组表达的VNAR与CD20的结合力。此外，通过CCK-8检测重组表达的VNAR对Raji淋巴瘤细胞的抑制作用，并通过细胞免疫荧光进一步验证VNAR与Raji淋巴瘤细胞表面CD20蛋白的结合能力。初步评价重组表达的VNAR的体外生物学活性。<br>　　结果:<br>　　1)成功进行了条纹斑竹鲨血清中IgNAR抗体水平检测抗体的制备。2)成功建立了一套新的免疫条纹斑竹鲨以制备抗体的方法，在保证免疫效果的同时提高了条纹斑竹鲨的存活率。3)通过噬菌体展示技术，成功筛选到了 18条能与CD20特异性结合的VNAR抗体序列。4)对选取的5条出现次数最多的抗体序列进行原核表达，与CD20均具有较好的结合能力。5）综合体外活性实验结果表明，筛选到的CD20-F9、CD20-F11以及CD20-G3这三条VNAR可以与Raji淋巴瘤细胞表面CD20结合并起到抑制Raji淋巴瘤细胞作用。<br>　　结论:<br>　　本研究所用免疫方案可以使条纹斑竹鲨产生特异性抗人CD20的单域抗体，并能够通过噬菌体展示技术筛选出来。在原核表达纯化后仍具有较好的活性,具有靶向目标抗原并起到抑制Raji淋巴瘤细胞的作用。本研究为B细胞淋巴瘤的治疗与药物开发提供了新的思路，也证明了在原核表达系统中重组表达的VNAR在肿瘤病理检测及临床治疗应用上具有巨大的潜力。