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摘要爵床科植物穿心莲(Andrographis paniculata)主要活性成分是含内酯环二萜穿心莲内酯(andrographolide,AD)和新穿心莲内酯(neoandrographolide,NAD),广泛用于治疗各类感染和急性肺损伤，来源单一且生物合成途径不明是限制其深度开发和药源供应的重要原因。其独特的内酯环具有较强物种特异性，是途径解析的难点。<br>　　随着合成生物学的迅速发展，基于大肠杆菌和酿酒酵母的微生物“细胞工厂”为催化酶的快速鉴定提供了高通量筛选平台也可以实现重要复杂天然产物的异源合成。同时，通过基因组、转录组和代谢组多组学整合分析可以更加准确地了解活性化合物生物合成和代谢的特点，实现候选基因更精准的定位。本研究重点关注穿心莲多组学数据的挖掘和大肠杆菌、酿酒酵母这两个微生物细胞工厂的构建，以及基于细胞工厂对多组学整合分析筛选出的候选穿心莲一类二萜合酶(KSL)和细胞色素P450单加氧酶(CYP)的功能验证。<br>　　基于植物二萜生物合成机制和穿心莲特异性内酯环的特殊性，对穿心莲二萜生物合成机制提出了 4种猜想，分别是KSL途径、CYP途径、焦磷酸酶途径和双加氧酶途径，其中主要考虑KSL途径和CYP途径。并且网络药理学数据库辅助补充了 15种穿心莲二萜化合物，依据二萜化合物结构的变化规律，对穿心莲活性二萜内酯生物合成步骤进行了合理推导，为寻找穿心莲关键酶基因提供了可靠依据。<br>　　通过多组学整合分析，并利用系统进化树与其它物种的功能基因进行同源比对,总共获得目标ApKSL基因6条，排除合作单位报道过的2条，获得4条ApKSL基因，进一步通过基因差异表达分析，确定了 2条ApKSL基因为候选基因。同时，经过筛选，共获得ApCYP基因369条，其中CYP71和CYP76家族共59条。在叶和茎中显著高表达的成员28条，进一步发现可被MeJA诱导表达的有23条。其中通过克隆获得了全长的ApCYP基因16条。<br>　　运用代谢工程的手段，向大肠杆菌底盘细胞中转化含拟南芥AtGGPPS基因和穿心莲一类二萜合酶基因ApCPS2的载体pGG-ApCPS2进行表达，成功构建了能够生产二萜通用前体ent-CPP的大肠杆菌底盘细胞。基于该底盘细胞验证了 2条候选ApKSL的功能，发现穿心莲二萜合酶ApKSL4可以催化ent-CPP生成ent-sandaracopimiradiene,ent-isopimiradiene和一种新的未知化合物。通过核磁对新产物进行结构鉴定，确定其为一种新的二萜化合物:(4aS,4bR,8S,8aS,10aR)-1,1,4a-trimethyl-7-methylene-8-vinyltetradecahydrophenanthrene,缩写为 TMV,分子式为C20H32。检测了 TMV在穿心莲各器官里的含量，该化合物在植物里微量分布，其中叶中含量为0.852±0.017 μg/g,穿心莲茎中的含量为0.472±0.152 μg/g。<br>　　通过CRISPR/Cas9技术，结合融合PCR的方法组装目的基因表达框，将ApCPS2和拟南芥细胞色素P450还原酶基因AtCPR1同源重组在基因组的中性位点进行表达,成功构建了产ent-CPP的酿酒酵母底盘细胞JZ1,并以该底盘细胞为基础，引入含有ApKSL4基因的表达框，通过基因组重构初步得到能产TMV的酿酒酵母细胞工厂。基于细胞代谢工程学的思路，过表达ERG10、HMG2和HMGr增强中心代谢，通过融合表达BTS1和PaGGPPS来增强萜类前体生物合成途径，通过构建ApCPS2和ApKSL4融合基因表达盒将代谢流引入产物TMV的生物合成方向以及通过过表达正向调控酿酒酵母代谢的转录因子ScUpc2来增强调控因子模块的策略优化了产TMV的酿酒酵母细胞工厂，使得TMV的产量从最初的34.62μg/L提升到了 386.42 μg/L,提升了 11.16倍。<br>　　利用CCK-8法检测TMV对RAW264.7细胞活力的影响，通过ELISA、qRT-PCR和Western Blot分别检测TMV对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌炎症因子的影响和对细胞炎症相关基因及蛋白表达的调控作用，系统地对TMV进行了抗炎活性评价。发现TMV具有一定的炎症抑制作用，同时抗炎效果随其浓度的升高而增强，是一种潜在的药效物质。<br>　　基于酿酒酵母和大肠杆菌两种微生物细胞工厂批量验证了 16条ApCYP的功能，结果发现ApCYP14能够催化ent-CPP产生一种未知产物，而其余15条ApCYP均没有明显的催化反应发生和新的产物生成。ApCYP14的催化产物的质谱图经过与NIST等数据库比对，未检索到匹配信息，有待进一步通过核磁指认，这一结果为穿心莲活性二萜内酯生物合成途径的解析提供了线索和可能。<br>　　综上所述，本研究针对穿心莲活性二萜生物合成途径解析困难的问题，成功构建了能够生产ent-CPP的大肠杆菌和酿酒酵母微生物细胞工厂。通过生物合成途径预测推导、多组学整合分析筛选关键酶基因和微生物细胞工厂验证候选基因功能，对穿心莲活性二萜生物合成途径进行了探索，并对新获得的二萜化合物进行了异源合成、产量优化和抗炎作用活性评价。本研究为穿心莲活性成分AD和NAD生物合成的解析、微生物细胞工厂的构建和改造奠定了基础，对穿心莲的药材质量控制，良种培育以及活性成分异源合成具有重要意义。