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摘要血管性认知功能障碍(Vascular Cognitive Impairment,VCI)是指由脑血管病及其危险因素导致的从轻度认知损害到痴呆的一类疾病，对家庭社会造成了极大的负担。脑白质病变(White Matter Lesions,WMLs)是VCI的重要病理改变，少突胶质细胞(Oligodendrocytes,OLs)是中枢神经系统髓鞘的形成细胞，也是VCI脑白质病变过程中受到病理攻击的主要靶细胞。高血压是导致WMLs最明确的危险因素，因其具有可治性而备受关注。经典机制认为高血压导致的脑小血管病变引起低灌注性WMLs,但越来越多的证据表明降压治疗的强度与减缓白质损伤的程度、认知预后的改善等并不完全平行，提示我们高血压可能并非仅依赖于血管病变的单一途径造成WMLs,极可能同时存在其他途径。本研究旨在筛选高血压导致VCI的关键致病因子，并探索其对OLs和髓鞘损伤的作用及相关机制，以期为VCI的防治提供新的干预靶点。<br>　　第一部分 高血压自然发生VCI大鼠模型的建立以及关键基因筛选与获得<br>　　研究目的：通过对自然发生VCI的高血压大鼠脑组织进行RNA测序，筛选并获得高血压导致VCI的关键基因。<br>　　研究方法：本部分研究，我们通过大鼠尾动脉测压、认知行为学、多模态磁共振等相关实验方法，采集6、12、18月龄自发性高血压大鼠(SHR大鼠)及野生京都威斯特大鼠(WKY大鼠)的血压及认知功能变化情况，影像学观察脑白质损伤情况。此外，之后对自然发生VCI的SHR大鼠及其同月龄的WKY大鼠的额叶皮层、海马、胼胝体多区域脑组织进行RNA-seq测序，应用生物信息学分析方法及Atlas数据库进行进一步分析。<br>　　研究结果：(1)SHR大鼠在6月龄时已经出现稳定的高血压表型，其收缩压、舒张压及平均动脉压均明显高于同月龄的WKY大鼠，均具有统计学差异;(2)相较于同月龄的WKY大鼠，SHR大鼠在6月龄时尚未出现认知损害，12月龄时开始出现认知损伤,18月龄时的认知损伤更为严重;(3)自然发生VCI的SHR大鼠较同月龄WKY大鼠已出现WMLs。结合转录组测序数据及多种生信分析方法，筛选出CHI3L1是SHR大鼠自然发生VCI表型的关键基因;(4)生信分析提示CHI3L1与肿瘤、炎症、免疫应答等生物过程具有紧密联系;(5)通过Atlas人单细胞测序数据库，推测出CHI3L1于SHR大鼠的脑中主要存在于星形胶质细胞。<br>　　研究结论：本部分我们对SHR大鼠进行长期的认知行为学监测，建立了高血压自然发生VCI的动物模型(VCI-SHR)。结合RNA-seq和一系列生物学分析方法，筛选出CHI3L1是SHR大鼠自然发生VCI表型的关键基因，可能主要来源于CNS中的星形胶质细胞，并与肿瘤、炎症、免疫应答等生物过程具有紧密联系。<br>　　第二部分 高血压伴VCI患者及VCI-SHR大鼠中CHI3L1的表达水平及细胞来源研究<br>　　研究目的：验证CHI3L1在高血压伴VCI患者外周血、大鼠模型外周血及脑组织中的蛋白表达水平，并明确在CHI3L1在高血压相关VCI大鼠模型(VCI-SHR)脑内主要的细胞来源。<br>　　研究方法：本部分研究中，我们通过免疫荧光双标染色观察脑切片中富含CHI3L1的细胞类型;通过原代培养星形胶质细胞及小胶质细胞，并以血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)处理细胞，免疫印迹实验检测CHI3L1蛋白表达水平，以验证高血压环境下CHI3L1主要的细胞来源;采用血清ELISA检测高血压VCI患者与VCI-SHR模型鼠外周血CHI3L1水平，免疫印迹实验检测VCI-SHR模型鼠脑组织CHI3L1蛋白表达水平。<br>　　研究结果：(1)与同月龄WKY组相比，6月龄SHR组对应海马区及海马CA1、CA3及DG各亚区内GFAP+CHI3L1+共表达细胞计数均无显著差异;而12月龄SHR组海马区GFAP+CHI3L1+共表达细胞计数较同龄WKY组升高(p＜0.05),但海马各亚区内GFAP+CHI3L1+共表达细胞计数无差异;18月龄SHR组海马区及海马三个亚区内GFAP+CHI3L1+共表达细胞计数较同月龄WKY对照组显著增加(p＜0.001,p＜0.001,p＜0.001,p＜0.001),均具有统计学意义;而整个海马及海马各亚区Iba1+CHI3L1+共表达细胞计数于6、12、18各月龄SHR组及其同月龄WKY组间均无差异;(2)外源性Ang Ⅱ能够刺激原代培养的星形胶质细胞合成、分泌CHI3L1,但未能观察到AngⅡ具有刺激小胶质细胞合成CHI3L1的作用;(3)6月龄、12月龄、18月龄三组SHR大鼠外周血清CHI3L1水平呈逐渐增高的趋势，其中12月龄及18月龄SHR大鼠外周血清、海马组织CHI3L1表达水平均较同龄WKY对照鼠均显著升高(p＜0.05,p＜0.05,p＜0.001,p＜0.001);(4)高血压伴VCI组患者血清中CHI3L1水平显著高于高血压不伴VCI组及健康对照组(p＜0.05,p＜0.01)。<br>　　研究结论：本部分研究提示，高血压VCI患者以及VCI-SHR大鼠的外周血CHI3L1水平均显著升高;VCI-SHR大鼠的海马组织CHI3L1蛋白表达水平也显著升高。在高血压环境下，CHI3L1在中枢神经系统中主要来源于星型胶质细胞，AngⅡ可能是促进星形胶质细胞分泌CHI3L1的重要上游调控分子，对小胶质细胞无类似效应。<br>　　第三部分 CHI3L1对VCI-SHR大鼠认知行为及髓鞘损伤的作用研究<br>　　研究目的：观察VCI-SHR大鼠脑内髓鞘及相关细胞的损伤情况，并通过拮抗CHI3L1观察对其认知功能改善、髓鞘修复的作用，并初步探讨可能的机制。<br>　　研究方法：在该部分实验中，我们分别对未发生VCI的6月龄SHR大鼠(NVCI-SHR)、发生VCI的18月龄SHR大鼠(VCI-SHR)、以及各自同龄的WKY大鼠，进行脑切片GFAP、Iba1、NeuN、GST-pi、MBP等标记的各类神经细胞及髓鞘的免疫组化染色，观察海马区不同神经细胞及髓鞘损伤情况，并通过LFB染色观察胼胝体白质区髓鞘损伤情况。同时通过免疫印迹法观察VCI-SHR及同龄对照WKY大鼠海马组织的CHI3L1蛋白及MBP表达情况，并进一步通过以K284-6111特异性拮抗CHI3L1,观察对SHR大鼠认知行为的改善以及对海马组织CHI3L1与MBP表达的改变;同时通过免疫印迹实验验证VCI-SHR大鼠相关通路NF-κB信号通路中P65磷酸化水平，以及拮抗CHI3L1对其产生的影响。<br>　　研究结果：(1)6月龄NVCI-SHR大鼠较同月龄的WKY对照大鼠海马区星形胶质细胞、小胶质细胞、神经元及少突胶质细胞的数量无明显变化，髓鞘染色无明显差异;而18月龄VCI-SHR大鼠较同月龄WKY对照大鼠海马区星形胶质细胞数量增加,其中CA3及DG区增加明显(p＜0.05,p＜0.05);小胶质细胞数量呈上升趋势，但无统计学差异;神经元数量无显著变化;少突胶质细胞数量与MBP水平均下降，其中DG区下降显著(p＜0.05,p＜0.05);(2)6月龄NVCI-SHR大鼠较同月龄的WKY对照大鼠胼胝体区LFB染色IOD值无显著差异;18月龄VCI-SHR大鼠较同月龄WKY对照大鼠胼胝体区LFB染色IOD值下降明显(p＜0.05);(3)免疫印迹实验显示，6月龄NVCI-SHR大鼠较同月龄的WKY对照大鼠海马组织CHI3L1蛋白、MBP蛋白均无明显变化，而18月龄VCI-SHR大鼠较同月龄WKY对照大鼠CHI3L1蛋白表达显著增加(p＜0.001),MBP蛋白表达量下降(p＜0.05);(4)通过K284-6111拮抗CHI3L1后，SHR大鼠在Morris水迷宫中的目标象限距离百分比、时间百分比均较对照显著上升(p＜0.05,p＜0.01),即认知损伤较对照有明确的改善，其海马组织CHI3L1蛋白表达下降、GST-pi 及 MBP 蛋白表达增加(p＜0.01,p＜0.05,p＜0.05);(5)VCI-SHR大鼠海马组织NF-κB通路的P65磷酸化水平显著升高(p＜0.05),抑制CHI3L1后可显著降低磷酸化P65水平(p＜0.05)。<br>　　研究结论：VCI-SHR大鼠海马区少突胶质细胞减少，髓鞘脱失，炎症细胞激活以星形胶质细胞为主，神经元改变不明显。CHI3L1抑制剂可改善VCI-SHR大鼠的认知功能，缓解髓鞘损伤。CHI3L1对脑白质髓鞘损伤的作用可能与NF-κB通路的P65磷酸化有关。