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摘要研究目的：<br>　　脓毒症是一种由感染引起的潜在致命的器官功能障碍性疾病。作为一种高致死率的疾病，脓毒症可导致细胞功能障碍，最终引起器官衰竭。肝脏是人体重要的免疫监视器官，由于常暴露于各种有害因素下，还容易成为脓毒症相关损伤的靶点。肝功能障碍是脓毒症的早期表现，也是脓毒症死亡率的独立预测指标。铁死亡是最常见和最古老的细胞死亡形式之一，其特征是不受控制的脂质过氧化。目前研究表明，铁死亡可以出现在各种肝脏疾病中，抑制铁死亡可以减轻肝脏的损伤。<br>　　大多数细胞表面受体属于G蛋白偶联受体(GPCR)家族，由于可以识别广泛的细胞外分子，参与许多生理和病理过程，GPCRs成为极具潜力的药物研究靶点。G蛋白偶联受体116(GPR116/ADGRF5)是黏附G蛋白偶联受体家族的成员，具有调节肺泡表面活性物质含量、参与肾脏酸分泌、增加胰岛素对白色脂肪组织的敏感性等功能。但其在脓毒症相关肝损伤中的作用尚未被报道。<br>　　本研究旨在阐明GPR116在脓毒症相关肝损伤发生发展中的作用和机制，以及与铁死亡的关联，为脓毒症相关肝损伤的防治提供潜在的生物标志物和治疗靶点。<br>　　研究方法：<br>　　1.体内实验<br>　　(1)GPR116在脓毒症肝损伤中表达变化的研究<br>　　选择雄性C57BL/6小鼠(8～12周，20～25 g,无特殊病原)随机分成2组:对照组和实验组，所有小鼠均喂食标准的食物和水，并在使用前使其适应环境。使用七氟醚麻醉小鼠，实验组小鼠用23号针建立盲肠结扎和穿刺(CLP)引起的脓毒症模型，对照组小鼠单纯开腹而不做盲肠结扎手术。在不同的时间点(0h、24h、48h)麻醉小鼠，心脏取血后处死小鼠，同时收集肝脏组织。利用全自动生化分析仪检测血清中的谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspertate aminotransferase,AST)的水平，同时利用不同的生化试剂盒检测肝脏组织中的丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)、水平。H&E染色观察肝脏损伤情况，透射电镜观察肝脏线粒体损伤情况。Western Blot法检测肝脏组织中GPR116和GPX4等蛋白的表达情况。<br>　　(2)GPR116在脓毒症小鼠肝损伤中作用及机制的研究<br>　　构建GPR116肝细胞特异性敲除小鼠(GPR116fl/flAlbcre-/-小鼠)。8～12周雄性GPR116fl/fl Albcre+/+和GPR116fl/flAlbcre-/-小鼠(20～25 g)随机分为:GPR116fl/fl Albcre+/++SHAM组、GPR116fl/flAlbcre+/++CLP组、GPR116fl/flAlbcre-/-+SHAM组、GPR116fl/flAlbcre-/-+CLP组，模型建立方法如前所述，所有小鼠均喂食标准的食物和水，并在使用前使其适应环境。48h后，麻醉小鼠，心脏取血后处死小鼠，同时收集肝脏组织，在此期间记录48h生存率。利用全自动生化分析仪检测血清中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶的水平，利用不同的生化试剂盒检测肝脏组织中的丙二醛、谷胱甘肽(glutathione,GSH)的水平。H&E染色观察肝脏损伤情况，透射电镜观察肝脏线粒体损伤情况。Western Blot法检测肝脏组织中GPR116、GPX4、SLC7A11、SLC3A2的表达情况。免疫组化染色法检测4-羟基壬烯醛(4-Hydro-xynonenal,4-HNE)的表达情况。使用铁死亡抑制剂Liproxstatin-1处理小鼠，检测4-HNE、ALT、AST和肝组织H&E染色，验证铁死亡在脓毒症肝损伤中的重要作用。<br>　　2.体外实验:验证GPR116在脓毒症小鼠肝损伤中的作用机制<br>　　体外培养小鼠肝细胞(AML12 cells),消化细胞，并按50～70％的密度接种到6孔板，37℃、5％CO2、95％空气的恒温培养箱孵育过夜，第二天换液之后将GPR116进行高表达或干扰处理。当细胞密度达到70％～80％时加入Erastin 10μmol刺激24h后收集细胞。<br>　　研究结果：<br>　　1.GPR116在脓毒症小鼠的肝组织中表达上调<br>　　CLP后，与SHAM组相比，CLP组的小鼠肝脏中GPR116的表达显著上调，峰值出现在48 h。CLP造模后也可观察到肝组织出现铁死亡。提示GPR116有可能参与脓毒症肝损伤的发生发展过程。<br>　　2.肝细胞特异性缺失GPR116的脓毒症小鼠肝损伤减轻<br>　　CLP后，与GPR116fl/flAlbcre+/小鼠相比，肝细胞特异性缺失GPR116(GPR116fl/flAlbcre-/-)的小鼠肝损伤减轻，死亡率也显著下降。说明肝细胞特异性缺失GPR116的脓毒症小鼠肝损伤减轻，肝细胞GPR116可能促进了脓毒症肝损伤进展。<br>　　3.GPR116通过抑制System Xc-/GSH/GPX4通路，促进肝脏铁死亡，加重肝损伤<br>　　CLP后，GPR116fl/flAlbcre-/-小鼠肝脏组织中铁死亡相关蛋白(GPX4、SLC7A11、SLC3A2)的表达增加;而GPR116fl/flAlbcre+/+则出现了相反的结果。说明GPR116通过抑制System Xc-/GSH/GPX4通路，促进肝脏铁死亡，从而加重了肝损伤。<br>　　4.GPR116加重Erastin刺激的AML12细胞的损伤<br>　　GPR116si-RNA干扰，Erastin(一种铁死亡激动剂)处理AML12细胞后，与对照组相比，GPR116干扰组细胞死亡率更低;而GPR116高表达处理，Erastin刺激细胞后，与对照组相比，GPR116高表达组细胞死亡率更高。说明GPR116加重了Erastin刺激的AML12细胞的损伤。<br>　　5.GPR116通过抑制system Xc-/GSH/GPX4通路，促进AML12细胞的铁死亡<br>　　GPR116干扰，Erastin处理AML12细胞后，与对照组相比，GPR116干扰组铁死亡相关蛋白(GPX4、SLC7A11、SLC3A2)的表达增加;而GPR116高表达处理，Erastin刺激细胞后，与对照组相比，GPR116高表达组铁死亡相关蛋白表达降低。说明GPR116通过抑制System Xc-/GSH/GPX4通路，促进AML12细胞铁死亡。<br>　　研究结论：<br>　　在脓毒症肝损伤中，GPR116在肝组织的表达增加，并通过抑制System Xc-/GSH/GPX4通路，促进铁死亡的发生，加重肝组织损伤。