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摘要目的：<br>　　本研究以OI模型鼠oim/oim小鼠(B6C3fe-α/α-Col1α2oim)为研究对象，拟从分子生物学水平、细胞生物学水平、体内动物水平三个层面进行实验。首先明确Ⅰ型胶原可降低成骨细胞对TGF-β刺激的敏感性;继而论证Ⅰ型胶原可通过Caveolin-1依赖内吞途径介导TβRⅠ降解，并对Ⅰ型胶原调控Caveolin-1磷酸化的具体机制展开深入研究;最后体内探讨抑制TβRⅠ活性治疗OI的疗效。本研究有望发现OI异常成骨的新机制，并为OI的治疗提供新靶点和新思路。<br>　　第一部分:Ⅰ型胶原诱导TβRⅠ降解负性调节TGF-β/Smad信号<br>　　方法:(1)获取OI模型鼠oim/oim小鼠及野生型wt/wt小鼠来源的成骨细胞作为研究对象，采用实时定量PCR(qRT-PCR)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色及茜素红S(Alizarin Red S,ARS)染色检测成骨分化及矿化情况。(2)TGF-β干预后，qRT-PCR、蛋白质印迹(western blot)检测成骨分化及Smad信号激活情况。(3)Western blot检测oim/oim成骨细胞和wt/wt成骨细胞膜表面TGF-β受体表达及降解情况;提取oim/oim小鼠及wt/wt小鼠鼠尾来源的Ⅰ型胶原，分别干预oim/oim成骨细胞和wt/wt成骨细胞后western blot检测TGF-β受体降解情况。<br>　　结果:(1)qRT-PCR结果显示，oim/oim成骨细胞成骨分化明显障碍，表现为成骨标志基因Runx2、ALP、OCN的表达水平显著降低，ALP染色、ARS染色结果显示oim/oim成骨细胞分化能力障碍及矿化抑制。(2)TGF-β干预后,qRT-PCR和western blot结果提示oim/oim成骨细胞成骨标志基因Runx2、ALP、OCN下降更为明显，oim/oim成骨细胞中被激活的Smad2、Smad3磷酸化水平显著高于wt/wt成骨细胞。(3)Western blot结果提示oim/oim成骨细胞膜表面TβRⅠ和TβRⅡ的蛋白水平显著高于wt/wt成骨细胞;oim/oim成骨细胞膜表面TβRⅠ和TβRⅡ降解障碍;正常的Ⅰ型胶原可诱导细胞膜表面TGF-β受体(TβRⅠ和TβRⅡ)下调，而OI中缺陷的Ⅰ型胶原诱导TGF-β受体下调的功能障碍。<br>　　结论:Oim/oim成骨细胞成骨分化障碍，同时与wt/wt成骨细胞相比，对TGF-β的成骨抑制作用更敏感。Oim/oim成骨细胞膜表面的TGF-β受体(TβRⅠ和TβRⅡ)表达量显著高于wt/wt成骨细胞，其可能与Ⅰ型胶原缺陷导致的TGF-β受体降解障碍有关。<br>　　第二部分:Caveolin-1依赖的内吞途径在Ⅰ型胶原调控TβRⅠ降解过程中的作用<br>　　方法:(1)提取oim/oim成骨细胞和wt/wt成骨细胞的膜蛋白样本，脂筏蛋白与非脂筏蛋白进行分离鉴定。(2)采用免疫荧光和western blot检测oim/oim成骨细胞和wt/wt成骨细胞中TβRⅠ降解途径的分布情况。(3)预先阻断微囊(Caveolae)/脂筏介导的内吞途径，溶酶体抑制剂、蛋白酶体抑制剂预处理成骨细胞后，给予正常Ⅰ型胶原干预，western blot检测TβRⅠ的内吞降解情况;正常Ⅰ型胶原干预后，Co-IP检测TβRⅠ泛素化。(4)采用western blot检测oim/oim成骨细胞和wt/wt成骨细胞中Caveolin-1(Cav-1)表达水平及Cav-1磷酸水平;oim/oim小鼠及wt/wt小鼠源的Ⅰ型胶原分别干预后，western blot检测oim/oim成骨细胞和wt/wt成骨细胞中Caveolin-1(Cav-1)表达水平及Cav-1磷酸水平;Cav-1 Y14(Tyr14)显性负性效应质粒转染成骨细胞，给予正常Ⅰ型胶原干预后，western blot检测TβRⅠ降解情况;整合素α2β1中和性抗体预处理后，给予正常Ⅰ型胶原干预，western blot检测Cav-1磷酸水平及TβRⅠ降解情况。(5)获取oim/oim成骨细胞和wt/wt成骨细胞，FAK抑制剂、Src激酶抑制剂预先阻断FAK/Src信号通路，Ⅰ型胶原干预后Western blot检测Cav-1磷酸水平和TβRⅠ降解情况。<br>　　结果:(1)Oim/oim成骨细胞中TβRⅠ在脂筏中分布减少，而在非脂筏中分布增加。(2)Oim/oim成骨细胞中微囊(Caveolae)介导的TβRⅠ降解途径减弱，而网格蛋白(Clathrin)介导的内吞途径增强。(3)Western blot结果提示，MβCD或genistein预处理可阻断Ⅰ型胶原对TβRⅠ的下调作用;溶酶体抑制剂NH4Cl和氯喹、蛋白酶体抑制剂MG132可部分阻断Ⅰ型胶原诱导的TβRⅠ降解。(4)Western blot结果显示，整合素α2β1中和性抗体可有效降低Cav-1(Tyr14)磷酸化水平，并显著逆转Ⅰ型胶原诱导的TβRⅠ下调。(5)Western blot结果显示，抑制FAK或Src激酶的活性均可有效阻断Ⅰ型胶原诱导的Cav-1磷酸化和TβRⅠ下调作用。<br>　　结论:Oim/oim成骨细胞中TβRⅠ在脂筏中分布减少及微囊(Caveolae)介导的TβRⅠ降解减弱。正常的Ⅰ型胶原可促进TβRⅠ泛素化并诱导其降解，这一过程是通过整合素α2β1/FAK/Src信号通路调控Cav-1磷酸化所介导。OI中缺陷的Ⅰ型胶原对整合素α2β1/FAK/Src介导Cav-1磷酸化和TβRⅠ降解的调控失常，导致TGF-β/Smad信号传导异常增强。<br>　　第三部分:抑制TβRⅠ激酶对OI模型鼠的治疗作用<br>　　方法:(1)获取4周龄雄性oim/oim小鼠和wt/wt小鼠，按照基因型(Oim或Wt)及治疗方案(Vehicle 或 SD-208)随机分为 4 组:Oim/Vehicle 组、Oim/SD-208 组、Wt/Vehicle组和Wt/SD-208组。口服管饲法喂食TβRⅠ激酶抑制剂SD-208(60mg/kg/天)或1％甲基纤维素(Vehicle),连续给药8周。(2)治疗前(4周龄)和治疗后每2周拍摄一次全身骨骼X线检查，直至治疗结束(12周龄)。(3)实验结束后，分离小鼠左侧股骨进行micro-CT扫描用于骨微结构分析。(4)取右侧股骨进行生物力学分析。(5)分离左侧胫骨进行动态骨形成分析。(6)取右侧胫骨进免疫组化染色。<br>　　结果:(1)抑制TβRⅠ激酶降低OI模型鼠的骨折发生。(2)抑制TβRⅠ激酶有效改善OI模型鼠的骨微结构。(3)三点弯曲试验结果提示抑制TβRⅠ激酶改善OI模型鼠的骨生物力学特性。(4)动态骨形成结果提示抑制TβRⅠ激酶促进OI模型鼠的骨形成和骨矿化沉积。(5)免疫组化结果提示抑制TβRⅠ激酶能有效改善OI模型鼠的骨代谢失衡，表现为同时刺激成骨形成并抑制破骨细胞形成。<br>　　结论:TβRⅠ激酶抑制剂SD-208可有效促进骨形成并抑制破骨细胞形成，对骨微结构和骨生物力学特性产生积极的改善作用，进而减少OI模型鼠的骨折发生。