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摘要目的:<br>　　1.CARM1是否影响椎间盘退变进展<br>　　2.抑制CARM1能否延缓椎间盘退变的发生发展<br>　　3.CARM1发挥作用的具体机制<br>　　方法:<br>　　1.CARM1在椎间盘退变的髓核组织及细胞中CARM1的表达情况及作用机制。<br>　　(1)临床根据Pfirrmann椎间盘退变分级，收集椎间盘退变患者髓核组织通过免疫印迹(Western blot,WB)和免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)检测 CARM1 表达情况。<br>　　(2)收集正常及手术诱导椎间盘退变C57BL/6小鼠的髓核标本，进行免疫荧光组化染色检测CARM1的表达情况。<br>　　(3)收集不同年龄段C57BL/6小鼠的椎间盘髓核标本，通过免疫荧光组化染色检测随年龄增长自然退变情况下CARM1的表达情况。<br>　　(4)提取髓核原代细胞及使用ATDC5细胞系，通过IL-1β浓度梯度(0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml)诱导炎症环境，检测 CARM1 是否高表达及与退变严重程度是否相关。<br>　　2.抑制/过表达CARM1对炎症环境下椎间盘组织及细胞合成分解代谢的研究。<br>　　(1)购置CARM1抑制剂，干预小鼠原代髓核细胞和构建过表达慢病毒转染髓核细胞，除正常对照组外，均加入炎症因子IL-1β，检测CARM1、MMP3、Col2a1、Aggrecan 等相关指标。<br>　　抑制剂组:<br>　　①NC组<br>　　②IL-1β组<br>　　③IL-1β+CARM1抑制剂(低浓度)组<br>　　④IL-1β+CARM1抑制剂(高浓度)组<br>　　过表达病毒组:<br>　　①空载病毒组(LV-NC)<br>　　② 过表达CARM1慢病毒组(LV-CARM1)<br>　　(2)购置36只2月龄的C57BL/6雄性小鼠，随机分6组，每组6只，分别为①Sham组②针刺组③针刺+CARM1抑制剂组④针刺+空载病毒组⑤针刺+CARM1过表达组⑥针刺+CARM1过表达+CARM1抑制剂组。除Sham组外其余5组均在异氟烷吸入麻醉(流量为300-500 ml/min)后椎间盘针刺，构建小鼠椎间盘退变模型。术后两周伤口愈合后，采用微量注射器关节腔内注射给药(或病毒)，依照分组每只椎间盘内注射药物(或病毒)/生理盐水0.4ul,每1周一次，首次注射2周后过量异氟烷吸入致死，取椎间盘标本。然后固定、脱钙、脱水、浸蜡包埋后石蜡切片进行番红固绿和阿新兰染色检测细胞外基质改变;进行免疫组化染色检测椎间盘组织细胞及细胞外基质合成及分解代谢。<br>　　3.抑制/过表达CARM1对炎症环境下髓核细胞增殖和凋亡的研究。<br>　　购置CARM1抑制剂抑制CARM1表达/构建CARM1慢病毒过表达CARM1,通过流式技术检测髓核细胞增殖和凋亡的变化情况。<br>　　4.CARM1通过调控NF-κB信号通路影响椎间盘退变的进展。<br>　　(1)通过免疫印迹检测椎间盘退变组织中NF-κB通路活化情况。<br>　　(2)在体内、体外实验中抑制/过表达CARM1后通过免疫印迹、免疫组化染色及荧光共定位检测NF-κB通路活化情况。<br>　　(3)NF-κB通路抑制剂抑制NF-κB通路活性后，检测椎间盘髓核细胞合成、分解代谢变化情况。<br>　　结果:<br>　　1.番红固绿、阿新蓝及CARM1免疫组化染色显示在椎间盘退变髓核组织中CARM1高表达;建立椎间盘针刺模型，结果显示CARM1在针刺组表达较对照组来说更为明显;在时间梯度组中，CARM1随着小鼠年龄增长，CARM1表达逐渐增高。<br>　　2.通过RTCA实验，我们测定CARM1抑制剂的适宜浓度为1μM、5μM;通过Western blot,我们得出CARM1抑制剂最适作用时间为24h; 流式实验结果显示CARM1抑制剂会减少IL-1β诱导的炎性环境下G1期停滞、减少细胞凋亡及增加细胞增殖;Western blot和qRT-PCR结果显示CARM1抑制剂会促进细胞外基质合成，降低细胞外基质降解。<br>　　3.将 C57 小鼠分为 3 组，① Normal,② CINs,③ CINs+CARM1 inhibitor,通过扫描X线、MRI结果得出:CINs促使椎间盘塌陷，含水量降低，在注射抑制剂之后，椎间盘塌陷有所缓解，椎间盘内含水量有所增加;番红固绿及免疫荧光组化得出:与CINs组相比，CINs+CARM1 inhibitor组的细胞外基质丢失更少，髓核细胞、纤维环、终板软骨破坏程度更轻。<br>　　4.构建CARM1慢病毒，Western blot和qRT-PCR结果显示:CARM1慢病毒构建成功，且CARM1过表达后，会促进细胞外基质降解;流式结果显示:CARM1过表达后会使细胞停滞在G1期从而减缓细胞增殖，促进细胞凋亡。<br>　　5.将C57小鼠分为3组，① vector,② OE CARM1,③ OE CARM1+inhibitor,通过扫描X线结果得出，OE CARM1促使椎间盘塌陷，在注射抑制剂之后，椎间盘塌陷有所缓解;番红固绿及免疫荧光组化得出:与OE CARM1组相比，OE CARM1+CARM1 inhibitor组的细胞外基质丢失更少，髓核细胞、纤维环、终板软骨破坏程度更轻。<br>　　6.Co-IP结果显示在免疫共沉淀之后，CARM1与P65有结合，猜测可能与出核入核有关。Western blot结果显示，在IL-1β诱导/OE CARM1时，促进P65磷酸化为PP65,加入CARM1 inhibitor后，上述情况得到缓解。共定位结果显示:IL-1β诱导下，P65磷酸化增加，加入CARM1 inhibitor后，上述情况得到缓解。<br>　　结论:<br>　　CARM1在体内与p300和NF-κB形成复合物，并在体外直接与NF-κB亚基P65相互作用，从而激活NF-κB通路，诱发炎症反应，导致椎间盘退变。CARM1 inhibitor逆转上述现象。