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摘要胃癌(Gastric cancer,GC)是全世界最常见的癌症类型之一，是一种具有高度侵袭性及异质性的恶性肿瘤，是全球第五大癌症死亡原因。尽管在过去的几十年里，许多地区胃癌的发病率已经下降，但在某些地区，特别是亚洲和拉丁美洲，其仍然是主要的健康问题。胃癌通常在早期没有明显症状，因此难以早期发现和治疗，目前临床上对于胃癌的治疗以外科手术、放化疗以及靶向治疗为主，但胃癌的发病率和死亡率仍然居高不下，究其原因是因为胃癌具有高度侵袭和转移的生物学特性，因此，我们需要进一步研究胃癌的发病机制以及预测胃癌预后的生物标志物，并且寻找一种能够抑制胃癌侵袭及转移的药物。<br>　　缝隙连接蛋白43(connexin 43)是细胞间连接蛋白的一种，主要在心肌细胞、血管内皮细胞、神经细胞和多种癌细胞中表达，其主要作用是形成细胞间连接(gap junction),将细胞与细胞之间的质子、荷电物质、小分子离子和信号分子等相互传递,从而维持细胞内稳态和相互协调。此外，Cx43蛋白还参与细胞凋亡、细胞分化、细胞周期调控、细胞迁移和肿瘤转移等多种生理和病理过程。近年来，许多研究表明，Cx43基因异常表达或突变与多种疾病相关，尤其在癌症治疗中引起了广泛关注，甚至有研究发现，一些药物可以通过调节Cx43基因表达和功能来抑制肿瘤的生长和转移，从而成为潜在的治疗策略，不过在胃癌中的表达以及相关作用机制还鲜有研究，值得更进一步的探索。<br>　　传统中医药(Traditional Chinese Medicine,TCM)已经有几千年的历史，目前已被广泛接受为癌症的替代治疗方法。薯蓣(Dioscorea cirrhosa Lour)又名怀山药，是薯蓣科，属藤本植物，性味甘平，具有补中益气、健脾开胃、滋阴润燥等功效，同时还可以刺激和调节人体的免疫系统，有抗肿瘤、抗病毒、抗衰老等功效。薯蓣皂苷(Dioscin,Dio)是薯蓣中最主要的一类化合物，具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等多种生物活性作用。在以前的研究中，有报道称薯蓣皂苷对多种癌细胞具有强效的抗癌作用，包括胃癌、结肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、子宫内膜癌和白血病等，但具体的作用机制仍不是很明确，有待进一步研究。<br>　　本课题组前期研究已证实，薯蓣皂苷具有明显的抗肿瘤作用，在抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭等方面成效显著，因此，本论文的主要目的是在网络药理学和生信分析的基础上研究薯蓣皂苷抑制胃癌上皮间质转化的作用和分子机制。本研究主要分为四个部分。<br>　　第一部分 基于网络药理学研究薯蓣皂苷抗胃癌的核心靶点基因及信号通路<br>　　目的:利用网络药理学和分子对接技术预测了薯蓣的有效成分薯蓣皂苷(Dio)抗胃癌(GC)的物质基础和作用机制。<br>　　方法:首先利用TCMSP、HERB、OMIM和Genecards数据库分别检索出薯蓣皂苷的潜在作用靶点，以及胃癌相关基因，再通过Venny 2.1.0在线工具获取薯蓣皂苷抗胃癌的关键靶点的韦恩图。随后运用STRING数据库和Cytoscape软件分析蛋白互作并建立PPI模型，再借助GO富集分析和KEGG通路富集分析探究薯蓣皂苷抗胃癌的物质基础和作用机制，最后通过Auto Dock Tools软件完成分子对接进行验证。<br>　　结果:薯蓣皂苷抗胃癌的核心靶点基因有47个。富集分析显示PI3K-Akt信号通路是重要的靶点通路，其中AKT1和MTOR这两个核心靶点基因在该信号通路上。分子对接结果显示，薯蓣皂苷与AKT1和MTOR之间存在良好的结合活性。<br>　　结论:薯蓣皂苷可能通过作用于AKT1和MTOR并通过PI3K-Akt信号通路发挥抗胃癌的效果。<br>　　第二部分 基于生信分析研究GJA1(Cx43)基因表达与胃癌的相关性<br>　　目的:通过生信分析探索GJA1(Cx43)在胃癌中的潜在作用机制及其免疫靶点治疗。<br>　　方法:借助TCGA数据库下载胃癌的RNA测序数据和临床表征数据，利用limma、survival、survminer、ggpubr和ComplexHeatmap包来反映 GJA1 的表达水平以及与临床参数和患者生存预后的关系。通过单因素和多因素分析探索GJA1的表达与临床特征的相关性。将胃癌中GJA1高低风险组的差异基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。<br>　　结果:GJA1可能是预后风险模型的独立预后指标，该风险评分的列线图可以预测胃癌患者的总生存时间。通过KEGG通路富集分析，筛选出排名靠前通路的主要涉及PI3K-Akt信号通路、钙信号通路、cAMP信号通路以及cGMP-PKG信号通路。<br>　　结论:GJA1可能是一个良好的预后标志物，并且可以通过调控PI3K-Akt信号通路抑制胃癌的发生发展。<br>　　第三部分 薯蓣皂苷靶向缝隙连接蛋白43抗胃癌细胞的作用及机制研究<br>　　目的:研究薯蓣皂苷抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭的作用和靶向缝隙连接蛋白43调控PI3K/Akt/mTOR信号通路的机制。<br>　　方法:慢病毒感染构建突变型Cx43G21R稳定细胞株。采用Western blot实验检测Cx43的蛋白表达水平。划痕标记荧光染料示踪技术检测细胞缝隙连接通讯。MTT法检测突变株Cx43G21R以及薯蓣皂苷给药后对细胞增殖活力的影响。划痕实验和Transwell侵袭迁移实验，探索突变株Cx43G21R和薯蓣皂苷对细胞迁移及侵袭能力的影响。通过Western Blot实验，检测突变Cx43基因和不同浓度薯蓣皂苷处理48 h后，人胃癌AGS细胞中Cx43、PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白及EMT相关蛋白的表达情况。<br>　　结果:突变株Cx43G21R的Cx43蛋白表达水平升高，荧光传输能力明显下降，给予薯蓣皂苷后，荧光传输能力恢复。与对照组相比，突变株Cx43G21R在增殖活力，迁移和侵袭能力方面显著升高，经薯蓣皂苷干预后，均明显下降。Western Blot实验结果显示,突变株Cx43G21R的Cx43蛋白表达水平升高，给药后，其表达进一步升高，并呈浓度依赖性。与对照组相比，突变株Cx43G21R的p-PI3K、p-Akt和p-mTOR水平均升高，经薯蓣皂苷干预后，均明显下降，然而PI3K、Akt和mTOR蛋白的表达水平均没有明显变化，差异无统计学意义，E-cadherin蛋白表达水平升高，而N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白的表达水平下降。<br>　　结论:薯蓣皂苷可以通过上调Cx43介导的缝隙连接通讯功能，调控PI3K/Akt/mTOR信号通路，从而抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化。<br>　　第四部分 薯蓣皂苷在体内靶向缝隙连接蛋白43抗胃癌的作用及机制研究<br>　　目的:研究薯蓣皂苷在体内抗胃癌增殖和上皮间质转化的作用及机制。<br>　　方法:构建裸鼠皮下移植瘤模型，将裸鼠随机分为4组，分别为Ctrl组、Cx43G21R组和薯蓣皂苷给药组(Cx43G21R+30mg/kg,Cx43G21R+60 mg/kg),右前腋下荷瘤，每只200μl。每三天测量一次体重和移植瘤大小。给药24天后摘瘤，随后通过免疫组织化学和Western Blot实验对肿瘤组织中相关蛋白的表达进行检测。<br>　　结果:与Ctrl组相比，Cx43G21R组的肿瘤体积增大，经薯蓣皂苷给药后，肿瘤体积均显著缩小，并呈浓度依赖性。免疫组织化学方法检测发现，Cx43G21R组中的Cx43蛋白表达较Vector组升高，薯蓣皂苷给药后，表达进一步升高。相比于Vector组，Cx43G21R组中E-cadherin蛋白表达下降，薯蓣皂苷给药组中的表达升高，而N-cadherin蛋白的表达水平在Cx43G21R组中显著升高，经薯蓣皂苷干预后表达呈浓度依赖性下降。Western Blot实验结果表明，与Ctrl组相比，Cx43G21R组的p-PI3K、p-Akt和p-mTOR水平均升高，经药后，均明显下降，然而PI3K、Akt和mTOR蛋白的表达水平变化没有统计学差异，E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达情况与免疫组化结果相同。<br>　　结论:薯蓣皂苷通过上调Cx43介导的缝隙连接通讯功能抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路，进而达到抗胃癌上皮间质转化的作用。