检索历史 清除

摘要为了适应不同的生活环境，脊椎动物进化出多种肢体形态。其中，鲸类进化出了鳍状前肢以适应海洋生境，因此成为研究肢体适应性进化发育的良好模型之一。以往的学者通过对小鼠、鸭子、蝙蝠等物种的研究表明，BMPs(Bmp2/ Bmp4/ Bmp7)和Grem1在指间组织中不同的表达会通过凋亡途径导致肢体形成不同的形态。尽管BMPs和Grem1也在鲸类指间组织中表达，但它们是否影响鲸类鳍状前肢的进化尚不清楚。近年来，虽然有学者推测可能在鲸类前肢发育过程中，由于其指间组织未发生细胞凋亡，导致五指未能游离开来从而形成鳍状前肢，但鲸类BMPs和Grem1是否影响其鳍状前肢形成，以及如何影响，目前仍然有待探究。已有不少研究表明，氨基酸突变是表型适应性进化的分子机制之一。因此，本文旨在探究鲸类BMPs和Grem1基因是否存在特异氨基酸突变，若存在，这些突变是否会通过抑制细胞凋亡从而参与鲸类鳍状前肢的形成。<br>　　为了解决以上科学问题，本研究首先对4个候选基因(Bmp2/ Bmp4/ Bmp7和Grem1)进行生物信息学分析。进一步，通过在NIH3T3细胞系中分别过表达携带候选基因的瓶鼻海豚序列、小鼠序列、鲸类特异氨基酸突变位点的小鼠序列的重组质粒，从细胞功能实验和分子表达水平检测两方面共同验证鲸类BMPs和Grem1特异氨基酸突变是否影响细胞凋亡。本研究的主要结果如下:<br>　　1、选择压力分析中，在鲸类祖先节点处鉴定到Bmp4存在加速进化信号(P=2.27* 10-5)以及18个正选择位点(P=2.92*10-4),鉴定到Bmp7存在加速进化信号，表明这两个基因在鲸类祖先节点可能受到海洋环境选择的作用;<br>　　2、在4个候选基因中共鉴定到了 7个鲸类特异的氨基酸替换，即Bmp2(G20V,D71G,I259R)、Bmp4(I79V,H247R)、Bmp7(Y180H)和 Grem1(M68V),且这些特异氨基酸突变均位于或临近基因的重要功能域，其中，Bmp4的第79和第249位特异氨基酸替换也被鉴定为正选择位点，表明这几个基因(尤其是Bmp4)的特异氨基酸突变可能影响其蛋白功能从而影响前肢发育过程中的细胞凋亡;<br>　　3、为了探究鲸类Bmp4及其特异氨基酸突变对其促凋亡功能的影响，Annexin-V/PI双染检测细胞凋亡实验发现携带鲸类特异氨基酸突变的小鼠Bmp4(mut-mBmp4)组和鲸类代表性物种瓶鼻海豚Bmp4(dBmp4)组的细胞凋亡水平显著降低;同时，CCK8细胞增殖检测实验也证实了上述结果，即mut-mBmp4组和dBmmp4组的细胞增殖水平显著升高。为了进一步探究细胞信号转导能力及凋亡相关因子的表达是否发生改变，我们检测了细胞内Bmp4、BMP信号通路细胞内介质Smad4、BMP信号通路下游靶基因Msx2以及凋亡相关因子Cyt C、Bax、Bcl2、Caspase2/3 的 mRNA 表达水平。结果显示，mut-mBmp4组和dBmp4组中Bmp4和Cyt C的表达下调，而Bcl2的表达则显著上调。其次，Western-blot检测结果发现鲸类BMP4、Cyt C和BAX的蛋白表达水平降低。以上结果均提示鲸类Bmp4特异氨基酸替换抑制细胞凋亡水平，这与鲸类形成鳍状前肢过程中细胞凋亡减少相一致;<br>　　4、同样，为了探究鲸类Bmp2/7及其特异氨基酸突变对其促凋亡功能的影响，细胞凋亡实验结果发现，小鼠Bmp2/7(mBmp2/7)组与携带鲸类特异氨基酸突变的小鼠Bmp2/7(mut-mBmp2/7)组具有相似的细胞凋亡水平。同时，细胞增殖水平检测结果也表明，mBmp2/7组与mut-mBmp2/7组的细胞增殖水平并无显著差异。进一步，RT-qPCR结果提示mBmp2/7组与mut-mBmp2/7组的Smad4、Msx2 以及 Cyt C、Bax、Bcl2、Caspase2/3 没有差异表达。Western-blot检测结果发现mBmp2/7组与mut-mBmp2/7组中p-SMAD1/5/8、MSX2、BAX、Cyt C蛋白并没有差异表达。以上结果均提示:鲸类Bmp2/7的特异氨基酸替换不影响其促凋亡功能，也并未导致凋亡相关因子表达量的改变。<br>　　5、Grem1为BMP信号的拮抗剂，为了探究鲸类Grem1的特异氨基酸突变是否影响BMP信号诱导的细胞凋亡水平，我们通过Hoechst3342/PI染色进行细胞凋亡检测，发现小鼠Grem1(mGrem1)组、携带鲸类特异氨基酸突变的小鼠Grem1(mut-mGrem1)组和鲸类代表性物种瓶鼻海豚Grem1(dGrem1)组之间的细胞凋亡水平并无显著差异。进一步，Western-Bolt结果也表明mGrem1组、mut-mGrem1组和dGrem1组中BAX蛋白表达没有显著差异。以上结果提示鲸类Grem1的特异氨基酸替换并不影响细胞凋亡。<br>　　总之，本研究通过分子进化分析和功能实验共同表明:①Bmp4在鲸类中的突变(I79V和H249R)可能抑制BMP4蛋白的促凋亡功能。在鲸类前肢发育过程中，这一结果可能会导致指间组织细胞凋亡的减少，从而促进鳍状前肢的形成;②虽然Bmp2/7和Grem1存在鲸类特异的氨基酸突变，但其可能不是鳍状前肢进化的潜在分子机制。