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摘要蛋白质错误折叠和聚集与许多人类疾病的发病息息相关，如帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症和亨廷顿舞蹈病。神经退行性疾病的一个常见病理特征是中枢神经系统中不溶性蛋白质聚集物的积累，而蛋白质聚集是一个多步骤的过程，它从自然折叠的蛋白质的部分展开开始，进一步进化成可溶性低聚物，最终形成不可溶性聚集物。因此，监测活细胞中的蛋白质聚集对于了解神经退行性疾病的分子机制和确定候选药物至关重要。<br>　　迄今为止，已经开发了各种方法来监测蛋白质，例如蛋白免疫印迹法(Western blotting)、紫外可见分光光度法(UV-Vis)、荧光共振能量转移(FRET),PROTEOSTAT检测试剂盒和荧光法等，但是这些方法都存在一定的缺点。Western blotting需要裂解细胞使其均质化而无法实现细胞内蛋白质的检测;UV-Vis荧光法无法实现细胞内蛋白质的检测;FRET和PROTEOSTAT试剂盒对荧光分子或细胞状态要求较高且在细胞上应用是有限的，而荧光法具有灵敏度高，操作简便，成本低等优点，并且在细胞中也可以实现对致病蛋白的标记,因此本研究采用荧光法对细胞内致病蛋白进行检测。<br>　　绿色荧光蛋白(GFP)发色团4-羟基苄基-咪唑啉酮(HBI)属于分子转子荧光团家族。基于此种发色团设计的衍生物，由于具有较好的生物相容性，高荧光量子产率和高亮度等优点，近几年作为荧光探针已广泛应用于生物成像。HBI可以在激发态沿单键旋转并通过扭曲的分子内电荷转移(TICT)发生非辐射衰变，因此可以通过化学和生物限制以及环境粘度抑制等外界条件抑制其在激发态的旋转恢复荧光发射，使能量以荧光的形式释放。基于这个荧光机理，本研究合成两种HBI发色团衍生物实现对蛋白质聚集体的检测:<br>　　(1)GFP生色团衍生物荧光探针用于蛋白质聚集体的检测<br>　　基于GFP发色团衍生物母核HBI,设计合成具有咔唑基团的GFP发色团衍生物前体，通过Knoevenagel缩合反应将具有不同电子性质的基团偶联到荧光团另一侧，形成P1-P5。通过对物理化学性质及微观机理分析，筛选出粘度响应最好的P1,为了特异性识别具有Halo标签的SOD1蛋白，将其进一步修饰Halo-Linker,形成P1-Halo。该目标分子不仅具有pH稳定性，对粘度环境的优异选择性，并且对热诱导产生的蛋白质聚集体具有明显的荧光响应，在活细胞应用时，P1-Halo可以清楚的标记蛋白质聚集体并呈现出明亮的黄色荧光，在小分子蛋白酶抑制剂存在情况下也可以实现对蛋白质聚集体的监测。该研究将GFP发色团衍生物P1-Halo成功应用于神经退行性疾病致病蛋白SOD1聚集体的标记，进一步丰富了实现致病蛋白聚集体检测的化学手段，为未来相关药物的研究提供研究基础。<br>　　（2）RFP生色团衍生物荧光探针用于蛋白质聚集体的检测<br>　　本研究仍采用HBI发色团衍生物进行致病蛋白的研究，同时引入了对氢键的理论计算分析，相对于GFP发色团衍生物，应用了光学性质稳定性且背景干扰更低的RFP发色团衍生物。在HBI母核杂环的Ⅰ位连接4-二乙氨基水杨醛，Ⅱ位连接含有两个羟基的基团以增强分子的水溶性，并将其与SNAP-Linker连接用于识别具有SNAP标签的SOD1蛋白，形成的P1-SNAP分子不仅在杂环处形成N-H…O氢键，可以使分子在激发态旋转时由于氢键的存在抑制作用增强而产生荧光增益，此外分子具有三个亲水性的羟基，在蛋白和细胞应用时具有生物相容性优势。P1-SNAP具有大斯托克位移，荧光量子产率高且pH稳定性和抗干扰性更强，在形成蛋白质聚集体的粘性环境中具有优异的荧光响应。此外，在MG132小分子蛋白酶抑制剂存在的情况下，靶标蛋白发生聚集并表现出明显的荧光增益现象，该RFP发色团衍生物对蛋白质聚集体的成功检测不仅在物理化学性质上相对于P1-Halo表现更优异，并且在先前研究基础上进一步丰富了化学机理，并有望为未来神经退行性疾病特效药的研究提供药物筛选平台。