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摘要目的<br>　　帕金森病是一种神经退行性疾病，其主要症状包括震颤、肌肉僵直、运动迟缓、障碍和平衡失调。有着较高的致残性和致病率，严重危害中老年人的健康。针灸疗法是基于传承几千年的中医经络学说发展而来的传统疗法，有其简易，绿色，无化学毒副作用的优势，更是广泛地应用于PD的防治中。实验研究表明，针灸有效防治PD的调控机制与炎症反应、内质网应激、自噬等相关，进而保护DA能神经元免于损伤或丢失，但具体效应机制仍不是很明确。因此，我们需要进一步研究针灸防治PD的相关作用机制，故亟待深入探讨针灸治疗PD的相关机制，为针灸治疗PD的临床应用奠定基础。<br>　　方法<br>　　1.实验动物:健康的雄性SPF级SD系大鼠51只，体重180±20g,所有大鼠先在SPF级实验动物中心分笼饲养一周，自由饮水和摄取灭菌食物。<br>　　2.动物分组:所有大鼠经3次行为学测试，排除实验动物约5％的死亡和不合格率，选取无异常的48只大鼠，编号，进入接下来的造模阶段,依据文献资料和前期研究基础，随机分为3组，正常组16只，模型组16只，电针组16只。<br>　　3.模型制作:模型组和电针组大鼠颈背部皮下注射鱼藤酮复制帕金森模型，具体操作:将鱼藤酮溶于4％的羧甲基纤维素(DSMO)和0.9％的氯化钠混合液(体积比7∶1),浓度为2mg/mL,根据大鼠质量给药，2mg/kg,1次/d,连续28d;正常组正常饲养，颈背部皮下注射不含鱼藤酮的等体积DMSO混合溶液，1次/d,连续28d。<br>　　4.理想模型评估:造模完成后从行为学观察上，动物出现躬背、主动活动减少、行动迟缓和毛发改变等征象以及悬挂实验和旷场实验中将模型组的大鼠的垂直运动得分和水平运动得分与正常组比较，有统计学差异（P＜0.05）。依照借鉴陈忻等研究学者早前发布的被证明行之有效的行为学评分规则，在造模结束后次日，对大鼠外观表现以及行为学改变进行评分，把分数大于2分，小于8分的模型大鼠视为造模成功，将行为异常不明显、濒临死亡甚至已死亡的大鼠（不在2-8分范围内）剔除。剩下的保留有36只，按照数字随机法分成正常组、模型组、电针组三组各12只。造模结束后，电针组继续进入电针治疗阶段。<br>　　5.治疗方法:电针组在大鼠完成28d造模后次日起开始电针治疗。参照《实验针灸学》（郭义、余曙光主编）内容，电针组治疗选用“风府穴”、“太冲穴”，于每日相同时间点进行电针治疗。将PD模型大鼠固定稳妥后，用0.5寸毫针针刺，连接G6805-2A型低频电子脉冲治疗仪，风府穴每日针刺，太冲穴左右足部隔日交替针刺，频率2Hz,电流强度1mA。1次/天，30min/次，连续治疗14天。<br>　　6.实验标本取材:正常组、模型组、电针组三组于同一天取材。剔除掉死亡、模型制备不合格的大鼠，最后每组大鼠选取10只取材。保持环境通风良好，每组随机选取6只在冰上迅速断头取脑，取中脑黑质组织匀浆备检。采用westernblot技术，测定大鼠中脑黑质TfR1,DMT1,FPN1,IRP2的蛋白表达。应用RT-PCR技术，对大鼠大脑黑质组织中TfR1mRNA,DMT1mRNA,FPN1mRNA,IRP2mRNA的基因表达进行研究;每组剩余4只行左心室多聚甲醛灌注内固定，取中脑黑质组织块，用于免疫组化形态学观察。<br>　　7.实验指标检测<br>　　（1）用于评估鉴定理想PD模型和电针影响PD模型大鼠行为学及黑质TH阳性表达的指标检测。<br>　　①行为学及外在形态观察:行为学评分、测试和自主活动观察。<br>　　②脑黑质组织形态学观察:石蜡切片，HE染色。<br>　　③脑黑质DA能神经元形态学观察、计数:免疫组织化学染色技术检测TH。<br>　　（2）用于电针通过IRE-IRP信号通路治疗PD模型大鼠的作用机制的指标检测。<br>　　①蛋白免疫印迹法（Westernblot技术）检测:脑黑质TfR1蛋白、DMT1蛋白、FPN1蛋白、IRP2蛋白的表达。<br>　　②实时荧光定量PCR技术检测:脑黑质TfR1mRNA、DMT1mRNA、FPN1mRNA、IRP2mRNA的基因表达。<br>　　8.统计学分析<br>　　使用SPASS25.0统计软件，对实验数据进行分析，使用均数±标准差（x±s）形式来表示，组间比较使用单因素方差分析（ONE-WAY-ANOVA）,继以SNK-q检验，P＞0.05时，差异无显著性意义;P＜0.05时，差异有显著性意义;P＜0.01时，差异有极显著性意义。<br>　　结果<br>　　1.大鼠行为学表现改变且行为学评分结果改变<br>　　与正常对照组比较，造模后大鼠外观、行为学指标均有显著变化（P＜0.01）;经过电针治疗，我们发现，电针干预后，大鼠外观、认知功能和行为表现较模型组有较大的改善（P＜0.01）。<br>　　2.行为学测试各组大鼠的运动数据变化<br>　　旷场实验中，造模后，与正常对照组相比，模型组大鼠在实验箱内主动运动的各项数据均明显降低（包括总路程、总时间、平均速度、跨越中心区域的次数、抬头和站起动作的次数），显著低于正常对照组;而停下来休息的总时长则显著高于正常对照组（P＜0.01）;经电针治疗后，与模型组比，电针组大鼠在实验箱内主动运动的各项数据均明显升高（包括总路程、总时间、平均速度、跨越中心区域的次数、向上抬头或站立运动的次数），停下来休息的总时间明显降低（均P＜0.01）。<br>　　3.各组大鼠中脑黑质TH的表达变化<br>　　造模完成后，大鼠中脑黑质区TH的平均光学浓度较正常对照组明显下降（P＜0.01);经过电针治疗，我们发现，电针干预后，与模型组比，电针组大鼠的中脑黑质区内TH浓度显著高于模型组（P＜0.01）。<br>　　4.各组大鼠中脑黑质TfR1、DMT1、FPN1、IRP2的蛋白表达变化<br>　　在造模完成之后，与正常对照组比较，在模型组大鼠中，大脑黑质中FPN1、IRP2的蛋白表达水平显著下降。DMT1、TfR1的蛋白表达水平显著升高(P＜0.01);经电针治疗后，与模型组相比，电针组大鼠中脑黑质FPN1和IRP2的表达量明显增加，而DMT1和TfR1的表达量则明显下降(P＜0.01)。<br>　　5.各组大鼠中脑黑质TfR1mRNA、DMT1mRNA、FPN1mRNA、IRP2mRNA的基因表达变化<br>　　在造模后，与正常对照组比较，模型组大鼠中脑黑质FPN1mRNA、IRP2mRNA的基因表达水平显著下降。DMT1mRNA、TfR1mRNA的基因表达水平明显升高。(P＜0.01);经电针治疗后，与模型组相比，电针组大鼠中脑黑质FPN1mRNA、IRP2mRNA的基因表达水平明显升高，DMT1mRNA、TfR1mRNA的基因表达水平大幅度降低(P＜0.01)。<br>　　结论<br>　　(1)鱼藤酮造模方法能成功制备出符合实验要求的PD模型大鼠。<br>　　(2)“风府、太冲”穴的电针治疗能延缓鱼藤酮诱导的PD模型大鼠的病理进程，改善其行为学的异常。<br>　　(3)“风府、太冲”穴的电针治疗可能通过IRE-IRP信号通路，上调膜铁转运蛋白(ferrloportin1,FPN1)、铁调节蛋白(IRP2,ironregulatoryprotein),下调转铁蛋白受体1(transferrinreceptorprotein1,TfR1)和二价金属离子转运体1(Divalentmetaltransporter1,DMT1),加快铁代谢，改善铁沉积，保护多巴胺能神经元,从而延缓PD的病理进程。