基于SIRT1/Kiss--1信号通路探讨九味楮实方对雌性CPP模型大鼠的影响及机制研究-论文-万方医学网

基于SIRT1/Kiss--1信号通路探讨九味楮实方对雌性CPP模型大鼠的影响及机制研究

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摘要目的 　　1.将九味楮实方开发为质量稳定、安全有效的颗粒剂，以惠及更多的性早熟患儿。 　　2.探讨九味楮实方治疗CPP的作用机制及靶点。本研究以NMA建立的雌性CPP模型大鼠为研究对象，围绕九味楮实方对CPP大鼠阴道口开放，性腺发育，不良心理行为，血清LH、FSH、E2表达水平，下丘脑及卵巢组织GnRH、SIRT1、Kiss-1、GPR54基因及蛋白表达的影响，探讨九味楮实方干预CPP大鼠是否与SIRT1/Kiss-1信号通路相关，进一步明确九味楮实方的作用机制及靶点。 　　方法 　　1.开展九味楮实方颗粒剂制备工艺及质量标准研究，确定九味楮实方的提取工艺与质量标准，为九味楮实方作为院内制剂广泛应用于临床性早熟患儿提供相关药理质控依据。 　　2.26日龄SPF级雌性SD大鼠，随机分为正常对照组（以下简称正常组）、CPP模型组（以下简称模型组）、戈那瑞林组（以下简称西药组）、九味楮实方高、中、低剂量组（以下简称高剂量组、中剂量组、低剂量组）,每组各8只。除正常组，其余各组大鼠分别于每日14:00和16:00皮下注射NMA（40mg/kg,溶于0.2ml生理盐水中），建立CPP模型大鼠;对照组于同一时间皮下注射0.9％氯化钠注射液（0.2ml/次）。造模同时，西药组予戈那瑞林皮下注射干预，高、中、低剂量组分别予高、中、低剂量的九味楮实方浸膏剂灌胃干预。干预期间，各组大鼠除特殊干预处理的具体方案不同，其余实验条件均尽量保持一致。正常组、模型组和高、中、低剂量组大鼠同西药组大鼠一样，在同时间段和部位皮下注射生理盐水,正常组、模型组及西药组大鼠同高、中、低剂量组大鼠一样，在同时段灌胃生理盐水。干预后，观察各组大鼠的一般情况、体质量、阴道口开放、动情周期，进行强迫游泳实验、糖水偏好实验、旷场实验。每日逐一观察模型组大鼠阴道口开放情况，对已开口的大鼠行阴道脱落细胞涂片检查,确定所处动情周期。根据动情周期确定大鼠停药及处死时间。根据检测要求，收集各组大鼠下丘脑、子宫、卵巢组织及外周血。采用HE染色观察并测量各组大鼠子宫内膜厚度、黄体数及卵泡数;采用ELISA检测各组大鼠血清LH、FSH、E2表达水平;采用RT-qPCR和WB检测各组大鼠下丘脑、卵巢GnRH基因及蛋白表达。 　　3.26日龄SPF级雌性SD大鼠，随机分为正常组、模型组、西药组、九味楮实方组(以下简称中药组)、九味楮实方+SIRT1抑制剂组(以下简称抑制剂组)、SIRT1激活剂组(以下简称激活剂组)，每组各8只。造模方式同前。造模同时，西药组予戈那瑞林皮下注射干预，中药组予九味楮实方浸膏剂(2.87ml/Kg)灌胃干预，抑制剂组予九味楮实方浸膏剂(2.87ml/Kg)灌胃，联合SIRT1抑制剂EX-527(5mg/kg)腹腔注射干预,激活剂组予SIRT1激活剂白藜芦醇溶液(100mg/kg)灌胃干预。根据动情周期确定大鼠停药及处死时间。根据检测要求，收集大鼠下丘脑及卵巢组织。采用RT-qPCR和WB检测各组大鼠下丘脑、卵巢SIRT1、Kiss-1、GPR54基因及蛋白表达。 　　结果 　　1.九味楮实方颗粒剂制备工艺及质量标准研究 　　1.1采用煎煮法对九味楮实方原材料进行提取，以芍药苷含量及出膏率作为评价指标，优选提取生产工艺为:按处方比例称取处方饮片，加10倍量水，提取2次，每次2h,浓缩得浸膏。验证试验中3批处方药材出膏率稳定，与优选工艺期望值一致，表明优选提取工艺稳定可行。 　　1.2采用湿法制粒的方法，对糊精用量、湿润剂浓度进行考察，优选得到九味楮实方颗粒剂的成型工艺为:取九味楮实颗粒浸膏按药辅比1∶1比例加入糊精，混匀，制粒，干燥后用12目筛整粒，按照每袋10g分装,得到成品。 　　1.3对九味楮实方颗粒剂中起主要作用的2味药材建立TLC鉴别方法，结果显示斑点清晰、阴性无干扰，可快速鉴定出九味楮实方颗粒剂中黄柏、醋（北）柴胡的存在。定量分析:选择筛选得到的代表性有效成分芍药苷作为评价指标，建立HPLC含量测定方法。芍药苷含量在19.1-286.5μg/mL范围内与峰面积线性关系良好，得到回归方程为Y=12745X+5610（r=0.9999）。方法学考察证明芍药苷HPLC含量测定方法准确、科学可行。测得3批九味楮实方颗粒剂中芍药苷的含量范围为1.4327-1.4979mg/g,均值为1.4620mg/g,RSD为1.47％。根据供试品的含量测定结果，结合本批原料药材白芍中芍药苷含量及《中国药典》（2020年版）关于白芍中药饮片的含量限度要求，暂定本品的含量限度为每袋（10g）含白芍以芍药苷（C23H28O11）计，不得少于4.0mg。对制剂的性状、粒度、水分、溶化性、装量差异、微生物限度进行检查，结果均符合《中国药典》（2020年版）的规定。 　　2.九味楮实方对雌性CPP大鼠一般行为学、心理行为及组织形态学的影响 　　2.1各组大鼠一般状况 　　各组大鼠造模过程中，偶有注射部位少量渗血，予75％医用酒精消毒后可自行恢复。实验过程中，各组大鼠摄食、饮水、活动均无异常，生长状况良好，毛发柔顺有光泽感，精神状态良好，体重保持增长，无异常死亡情况。 　　2.2各组大鼠体质量 　　干预前，各组大鼠体质量无明显差异;干预后，模型组、低剂量组大鼠体质量明显高于正常组;西药组、高剂量组及中剂量组大鼠体质量明显低于模型组。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 　　2.3各组大鼠阴道口开放 　　相较于正常组，模型组、低剂量组大鼠阴门开启时间显著提前;相较于模型组，西药组、高剂量组及中剂量组大鼠阴门开启时间显著延迟。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 　　2.4模型组大鼠阴道脱落细胞涂片 　　模型组大鼠建立稳定、规律的动情周期。 　　2.5各组大鼠子宫内膜厚度、黄体数及卵泡数 　　相较于正常组，模型组大鼠子宫内膜厚度显著增加;与模型组相比,西药组、高剂量组及中剂量组大鼠子宫内膜厚度显著降低。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。相较于正常组，模型组及低剂量组大鼠黄体数显著增加;与模型组相比，西药组、高剂量组及中剂量组大鼠黄体数显著减少;与中剂量组相比，低剂量组大鼠黄体数显著增加。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。相较于正常组，模型组大鼠卵泡数显著增加;与模型组相比，西药组、高剂量组及中剂量组大鼠卵泡数显著减少。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 　　2.6不良心理行为 　　2.6.1强迫游泳实验 　　相较于正常组，模型组、低剂量组大鼠不动时间显著增加;相较于模型组，西药组、高剂量组、中剂量组及低剂量组大鼠不动时间显著缩短。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 　　2.6.2糖水偏好实验 　　相较于正常组，模型组大鼠糖水偏好率显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）;相较于模型组，西药组、高剂量组、中剂量组及低剂量组大鼠糖水偏好率稍增加，差异无统计学意义（P＞0.05）。 　　2.6.3旷场实验 　　相较于正常组，模型组、西药组、高剂量组、中剂量组及低剂量组大鼠运动总距离显著减少;相较于模型组，高剂量组及中剂量组大鼠运动总距离显著增加;与西药组相比，高剂量组及中剂量组大鼠运动总距离显著增加;与高剂量组相比，低剂量组大鼠运动总距离显著减少;与中剂量组相比，低剂量组大鼠运动总距离显著减少。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。这表明九味楮实方在调节CPP大鼠运动总距离上存在量效关系。相较于正常组，模型组、西药组、高剂量组、中剂量组及低剂量组大鼠中央区域停留时间显著减少;相较于模型组，高剂量组及中剂量组大鼠中央区域停留时间显著增加;与西药组相比，高剂量组及中剂量组大鼠中央区域停留时间显著增加;与高剂量组相比，低剂量组大鼠中央区域停留时间显著减少;与中剂量组相比，低剂量组大鼠中央区域停留时间显著减少。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。这表明九味楮实方在调节CPP大鼠中央区域停留时间上存在量效关系。 　　3九味楮实方对雌性CPP大鼠血清LH、FSH、E2表达的影响 　　3.1各组大鼠血清LH水平 　　相较于正常组，模型组、西药组、中剂量组及低剂量组大鼠LH表达水平显著升高;西药组、高剂量组及中剂量组相较于模型组大鼠LH表达水平显著降低;与高剂量组相比，低剂量组大鼠LH表达水平显著升高。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 　　3.2各组大鼠血清FSH水平 　　相较于正常组，模型组、中剂量组及低剂量组大鼠FSH表达水平显著升高;西药组、高剂量组、中剂量组及低剂量组相较于模型组大鼠FSH表达水平显著降低;与西药组相比，中剂量组及低剂量组大鼠FSH表达水平显著升高;与高剂量组相比，低剂量组大鼠FSH表达水平显著升高;与中剂量组相比，低剂量组大鼠FSH表达水平显著升高。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。这表明九味楮实方在调节CPP大鼠FSH表达水平上存在量效关系。 　　3.3各组大鼠血清E2水平 　　相较于正常组，模型组、高剂量组、中剂量组及低剂量大鼠E2表达水平显著升高;西药组、高剂量组及中剂量组相较于模型组大鼠E2表达水平显著降低;与西药组相比，高剂量组、中剂量组及低剂量组大鼠E2表达水平显著升高;与高剂量组相比，低剂量组大鼠E2表达水平显著升高。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 　　4.九味楮实方对雌性CPP大鼠下丘脑、卵巢GnRH基因及蛋白表达的影响 　　4.1各组大鼠下丘脑GnRH基因表达水平比较 　　相较于正常组，模型组、西药组、高剂量组、中剂量组及低剂量组大鼠下丘脑GnRH基因表达水平显著增加;西药组、高剂量组及中剂量组相较于模型组大鼠下丘脑GnRH基因表达水平显著降低;与西药组相比,低剂量组大鼠下丘脑GnRH基因表达水平显著增加;与高剂量组相比，低剂量组大鼠下丘脑GnRH基因表达水平显著增加;与中剂量组相比，低剂量组大鼠下丘脑GnRH基因表达水平显著增加。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。表明九味楮实方在调节CPP大鼠下丘脑GnRH基因表达水平上存在量效关系。 　　4.2各组大鼠卵巢GnRH基因表达水平比较 　　相较于正常组，模型组、西药组、高剂量组、中剂量组及低剂量组大鼠卵巢GnRH基因表达水平显著增加;西药组、高剂量组、中剂量组及低剂量组相较于模型组大鼠卵巢GnRH基因表达水平显著降低;与西药组相比，高剂量组、中剂量组及低剂量组大鼠卵巢GnRH基因表达水平显著增加;与高剂量组相比，低剂量组大鼠卵巢GnRH基因表达水平显著增加;与中剂量组相比，低剂量组大鼠卵巢GnRH基因表达水平显著增加。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。表明九味楮实方在调节CPP大鼠卵巢GnRH基因表达水平上存在量效关系。 　　4.3各组大鼠下丘脑GnRH蛋白表达水平比较 　　相较于正常组，模型组、西药组、高剂量组、中剂量组及低剂量组大鼠下丘脑GnRH蛋白表达水平显著增加;西药组、高剂量组、中剂量组、低剂量组相较于模型组大鼠下丘脑GnRH蛋白表达水平显著降低;与西药组相比，中剂量组及低剂量组大鼠下丘脑GnRH蛋白表达水平显著增加。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 　　4.4各组大鼠卵巢GnRH蛋白表达水平比较 　　相较于正常组，模型组、西药组、高剂量组、中剂量组及低剂量组大鼠卵巢GnRH蛋白表达水平显著增加;西药组、高剂量组及中剂量组相较于模型组大鼠卵巢GnRH蛋白表达水平显著降低;与西药组相比，高剂量组、中剂量组及低剂量组大鼠卵巢GnRH蛋白表达水平显著增加。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 　　5.九味楮实方对雌性CPP大鼠SIRT1/Kiss-1信号通路的影响 　　5.1各组大鼠下丘脑、卵巢SIRT1基因表达水平 　　相较于正常组，模型组、西药组、中药组、抑制剂组及激活剂组大鼠下丘脑SIRT1基因表达水平显著偏低;西药组、中药组、抑制剂组及激活剂组相较于模型组大鼠下丘脑SIRT1基因表达水平显著偏高;相较于西药组，激活剂组大鼠下丘脑SIRT1基因表达水平显著偏高、抑制剂组大鼠下丘脑SIRT1基因表达水平显著偏低;与中药组相比，抑制剂组大鼠下丘脑SIRT1基因表达水平显著偏低;与抑制剂组相比，激活剂组大鼠下丘脑SIRT1基因表达水平显著偏高。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。相较于正常组，模型组、西药组、中药组、抑制剂组及激活剂组大鼠卵巢SIRT1基因表达水平显著偏低;西药组、中药组、抑制剂组及激活剂组相较于模型组大鼠卵巢SIRT1基因表达水平显著偏高;相较于西药组，激活剂组大鼠卵巢SIRT1基因表达水平显著偏高、抑制剂组大鼠卵巢SIRT1基因表达水平显著偏低;与中药组相比，激活剂组大鼠卵巢卵巢SIRT1基因表达水平显著偏高、抑制剂组大鼠卵巢SIRT1基因表达水平显著偏低;与抑制剂组相比，激活剂组大鼠卵巢SIRT1蛋白表达水平显著偏高。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 　　5.2各组大鼠下丘脑、卵巢Kiss-1基因表达水平 　　相较于正常组，模型组、西药组、中药组、抑制剂组及激活剂组大鼠下丘脑Kiss-1基因表达水平显著偏高;西药组、中药组、抑制剂组及激活剂组相较于模型组大鼠下丘脑Kiss-1基因表达水平显著偏低;相较于西药组，抑制剂组大鼠下丘脑Kiss-1基因表达水平显著偏高;与中药组相比，抑制剂组大鼠下丘脑Kiss-1基因表达水平显著偏高;与抑制剂组相比，激活剂组大鼠下丘脑Kiss-1基因表达水平显著偏低。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。相较于正常组，模型组、西药组、中药组、抑制剂组及激活剂组大鼠卵巢Kiss-1基因表达水平显著偏高;西药组、中药组、抑制剂组及激活剂组相较于模型组大鼠卵巢Kiss-1基因表达水平显著偏低;相较于西药组，中药组、抑制剂组及激活剂组大鼠卵巢Kiss-1基因表达水平偏高;与中药组相比，抑制剂组大鼠卵巢Kiss-1基因表达水平显著偏高;与抑制剂组相比，激活剂组大鼠卵巢Kiss-1基因表达水平显著偏低。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 　　5.3各组大鼠下丘脑、卵巢GPR54基因表达水平 　　相较于正常组，模型组、中药组、抑制剂组及激活剂组大鼠下丘脑GPR54基因表达水平显著偏高;西药组、中药组及激活剂组相较于模型组大鼠下丘脑GPR54基因表达水平显著偏低;相较于西药组，抑制剂组及激活剂组大鼠下丘脑GPR54基因表达水平显著偏高;与中药组相比，抑制剂组大鼠下丘脑GPR54基因表达水平显著偏高;与抑制剂组相比，激活剂组大鼠下丘脑GPR54基因表达水平显著偏低。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。相较于正常组，模型组、西药组、中药组、抑制剂组及激活剂组大鼠卵巢GPR54基因表达水平显著偏高;西药组、中药组及激活剂组相较于模型组大鼠卵巢GPR54基因表达水平显著偏低;相较于西药组，中药组、抑制剂组及激活剂组大鼠卵巢GPR54基因表达水平显著偏高;与中药组相比，抑制剂组大鼠卵巢GPR54基因表达水平显著偏高;与抑制剂组相比，激活剂组大鼠卵巢GPR54基因表达水平显著偏低。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 　　5.4各组大鼠下丘脑、卵巢SIRT1蛋白表达水平 　　相较于正常组，模型组、西药组、中药组、抑制剂组及激活剂组大鼠下丘脑SIRT1蛋白表达水平显著偏低;西药组、中药组、抑制剂组及激活剂组相较于模型组大鼠下丘脑SIRT1蛋白表达水平显著偏高;相较于西药组，激活剂组大鼠下丘脑SIRT1蛋白表达水平显著偏高、抑制剂组大鼠下丘脑SIRT1蛋白表达水平偏低;与中药组相比，激活剂组大鼠下丘脑SIRT1蛋白表达水平显著偏高;与抑制剂组相比，激活剂组大鼠下丘脑SIRT1蛋白表达水平显著偏高。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。相较于正常组，模型组、西药组、中药组及抑制剂组大鼠卵巢SIRT1蛋白表达水平显著偏低;西药组、中药组、抑制剂组及激活剂组相较于模型组大鼠卵巢SIRT1蛋白表达水平显著偏高;相较于西药组，中药组及激活剂组大鼠卵巢SIRT1蛋白表达水平显著偏高、抑制剂组大鼠卵巢SIRT1蛋白表达水平显著偏低;与中药组相比，激活剂组大鼠卵巢SIRT1蛋白表达水平显著偏高、抑制剂组大鼠卵巢SIRT1蛋白表达水平显著偏低;与抑制剂组相比，激活剂组大鼠卵巢SIRT1蛋白表达水平显著偏高。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 　　5.5各组大鼠下丘脑、卵巢Kiss-1蛋白表达水平 　　相较于正常组，模型组、西药组、中药组、抑制剂组及激活剂组大鼠下丘脑Kiss-1蛋白表达水平显著偏高;西药组、中药组、激活剂组相较于模型组大鼠下丘脑Kiss-1蛋白表达水平显著偏低;相较于西药组，中药组、抑制剂组及激活剂组大鼠下丘脑Kiss-1蛋白表达水平显著偏高;与中药组相比，抑制剂组大鼠下丘脑Kiss-1蛋白表达水平显著偏高。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。相较于正常组，模型组、西药组、中药组、抑制剂组及激活剂大鼠卵巢Kiss-1蛋白表达水平显著偏高;西药组、中药组、激活剂组相较于模型组大鼠卵巢Kiss-1蛋白表达水平显著偏低;相较于西药组，中药组、抑制剂组及激活剂组大鼠卵巢Kiss-1蛋白表达水平显著偏高;与中药组相比，抑制剂组大鼠卵巢Kiss-1蛋白表达水平显著偏高;与抑制剂组相比，激活剂组大鼠卵巢Kiss-1蛋白表达水平显著偏低。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 　　5.6各组大鼠下丘脑、卵巢GPR54蛋白表达水平 　　相较于正常组，模型组、中药组、抑制剂组及激活剂大鼠下丘脑GPR54蛋白表达水平显著偏高;西药组、中药组、抑制剂组、激活剂组相较于模型组大鼠，下丘脑GPR54蛋白表达水平显著偏低;相较于西药组，抑制剂组大鼠下丘脑GPR54蛋白表达水平显著偏高;与中药组相比，抑制剂组大鼠下丘脑GPR54蛋白表达水平显著偏高;与抑制剂组相比，激活剂组大鼠下丘脑GPR54蛋白表达水平显著偏低。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。相较于正常组，模型组、抑制剂组及激活剂大鼠卵巢GPR54蛋白表达水平显著偏高;西药组、中药组、激活剂组相较于模型组大鼠卵巢GPR54蛋白表达水平显著偏低;相较于西药组，抑制剂组大鼠卵巢GPR54蛋白表达水平显著偏高;与中药组相比，抑制剂组大鼠卵巢GPR54蛋白表达水平显著偏高;与抑制剂组相比，激活剂组大鼠卵巢GPR54蛋白表达水平显著偏低。以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）。 　　结论 　　1.经制备工艺及质量标准研究，研制出用药配伍合理、制备工艺科学可行、质量稳定可控的九味楮实方颗粒剂。 　　2.CPP大鼠阴道口提前开放，建立规律的动情周期，子宫内膜厚度、黄体数及卵泡数增加，并产生不良心理行为。九味楮实方可以延缓CPP大鼠阴道口开放，抑制性腺发育并改善不良心理行为。 　　3.CPP大鼠LH、FSH、E2分泌增加，九味楮实方可以显著降低CPP大鼠LH、FSH、E2表达水平，调控垂体-性腺轴功能，抑制性腺发育。 　　4.CPP大鼠下丘脑、卵巢GnRH基因及蛋白表达水平显著增加，九味楮实方通过抑制下丘脑GnRH神经元活性，减少GnRH分泌，调控HPGA功能，对CPP发挥治疗作用。 　　5.CPP大鼠下丘脑及卵巢组织中，Kiss-1/GPR54系统表达显著增加、SIRT1基因及蛋白表达水平显著降低，SIRT1可以调节Kiss-1、GPR54基因及蛋白表达水平，从而影响GnRH分泌，调控HPGA功能，参与CPP发生发展。九味楮实方可以激活SIRT1活性，调节Kiss-1/GPR54系统表达，抑制GnRH神经元活性，降低GnRH分泌，对CPP大鼠发挥表观遗传调控，可能是中药治疗CPP的潜在作用机制。