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摘要乳腺肿瘤为人和动物常发疾病，在临床上多表现为恶性，其发病率和死亡率逐年增加，严重威胁人类及动物生命健康;乳腺炎是严重制约世界奶牛养殖业和乳制品行业的重要疾病。上皮间质转化(EMT)是导致乳腺肿瘤细胞迁移、侵袭以及乳腺上皮细胞纤维化的重要原因，然而EMT在乳腺癌和乳腺纤维化中的作用机制尚不清楚。本研究第一部分旨在探讨TGF-β1/Smad3和IL-6/JAK1/STAT3通路介导小鼠乳腺肿瘤细胞上皮间质转化的分子细节，解析6-溴-靛玉红-3''-肟(6BIO)干预乳腺肿瘤细胞上皮间质转化的作用及分子调控机制，为临床上乳腺癌的治疗提供新策略。本研究第二部分旨在初步探讨脂多糖(LPS)促进TGF-β1诱导奶牛乳腺上皮细胞上皮间质转化的作用机制，为临床上防控乳腺炎的药物开发提供新方向。本研究使用qPCR、Transwell、平板克隆实验、免疫荧光实验、划痕实验、siRNA干扰技术、过表达载体的构建及Westernblot,流式细胞术等实验方法进行验证，具体研究结果如下:<br>　　1.TGF-β1诱导小鼠乳腺肿瘤细胞上皮间质转化的机制研究<br>　　利用10ng/mLTGF-β1刺激小鼠乳腺肿瘤细胞60h,上皮细胞标志物E-cadherin的mRNA表达量显著降低(p＜0.001),间质细胞标志物MMP9、Fibronectin、α-SMA、Snail1的mRNA表达量显著升高(p＜0.001);在细胞形态上，TGF-β1以剂量依赖方式促进4T1细胞由铺路石样向纤长形态转变。在蛋白水平上，E-cadherin(p＜0.001)表达量显著降低，MMP9(p＜0.001)、P-Smad3(p＜0.05)的表达量升高;与未经处理空白对照组相比，划痕实验中TGF-β1处理组4T1细胞迁移百分比显著增加(p＜0.001),Transwell实验中TGF-β1处理组侵袭(p＜0.01)和迁移(p＜0.05)的细胞数量显著增加;与空白对照组相比，TGF-β1处理组4T1细胞的DNA复制活性显著增加(p＜0.01),细胞克隆数量明显上升(p＜0.001)。此外，TGF-β1能显著促进抑凋亡蛋白PARP、Bcl-2的表达(p＜0.001),抑制凋亡蛋白Caspase3(p＜0.01)的表达，降低细胞凋亡率(p＜0.001)。<br>　　2.IL-6诱导小鼠乳腺肿瘤细胞上皮间质转化的机制研究<br>　　在mRNA和蛋白水平上，TGF-β1促进IL-6分泌，但IL-6不能上调TGF-β1的表达，推测IL-6位于TGF-β1下游。利用25ng/mLIL-6刺激小鼠乳腺肿瘤细胞60h,E-cadherin的mRNA表达量显著下降(p＜0.001),Fibronectin(p＜0.05)、Snail1(p＜0.001)、Zeb2(p＜0.001)及Twist1(p＜0.001)的mRNA表达量显著增加;在细胞形态上，IL-6促进4T1细胞由铺路石样向纤长形态转变;在蛋白水平上，E-cadherin表达量显著降低(p＜0.01),MMP9、Vimentin、α-SMA、P-STAT3表达量显著增加(p＜0.01);与未经处理空白对照组相比，划痕实验中IL-6处理组4T1细胞迁移百分比显著增加(p＜0.001),Transwell实验中IL-6处理组侵袭(p＜0.001)和迁移(p＜0.01)的细胞数量显著增加;与空白对照组相比，IL-6处理组4T1细胞的DNA复制活性显著增加(p＜0.01)，细胞克隆数量明显上升(p＜0.05)。此外，IL-6能显著促进抑凋亡蛋白PARP(p＜0.01)的表达，抑制凋亡蛋白Caspase3(p＜0.01)的表达，降低细胞凋亡率（p＜0.01)。<br>　　3.6BIO抑制TGF-β1诱导4T1细胞上皮间质转化的机制研究<br>　　CCK-8检测发现25-1000nM6BIO不影响4T1细胞活力;5nM6BIO作用下，E-cadherin的mRNA表达量显著升高(p＜0.05),MMP9(p＜0.01)、Fibronectin(p＜0.05)、N-cadherin(p＜0.01)、Snail1(p＜0.05)、α-SMA(p＜0.01)及IL-6(p＜0.001)的mRNA表达量显著降低;在细胞形态上，6BIO能剂量依赖性抑制TGF-β1诱导的4T1细胞由铺路石样向纤长形态转变。在蛋白水平上，6BIO作用后E-cadherin表达显著增加(p＜0.01),Vimentin(p＜0.01)、IL-6(p＜0.001)与P-Smad3(p＜0.001)表达明显下降;与TGF-β1处理组相比，划痕实验中6BIO和TGF-β1共处理组4T1细胞迁移百分比显著下降（p＜0.001),Transwell实验中6BIO和TGF-β1共处理组侵袭(p＜0.001)和迁移(p＜0.001)的细胞数量显著下降;与空白对照组相比，6BIO处理组4T1细胞的DNA复制活性显著降低(p＜0.05),细胞克隆数量明显减少(p＜0.05)。此外，6BIO能显著增加4T1细胞凋亡率(p＜0.01)。<br>　　4.IL-6介导TGF-β1/Smad通路调控上皮间质转化的机制研究<br>　　利用小干扰RNA(SiRNA)对4T1细胞中IL-6基因进行敲低。SiIL-6作用下，E-cadherin的mRNA表达量明显增加(p＜0.05),Fibronectin和MMP9的mRNA表达量显著减少（p＜0.01);在蛋白水平上，SiIL-6处理后E-cadherin表达显著上升，IL-6(p＜0.001)、P-STAT3(p＜0.001)、Snail1(p＜0.001)、Vimentin(p＜0.01)及P-Smad3(p＜0.01)表达显著降低;与TGF-β1处理组相比，划痕实验中SiIL-6和TGF-β1共处理组4T1细胞迁移百分比显著降低(p＜0.001);Transwell实验中SiIL-6和TGF-β1共处理组侵袭(p＜0.001)和迁移(p＜0.001)的细胞数量显著下降;与空白对照组相比，SiIL-6处理组4T1细胞的DNA复制活性显著降低(p＜0.01),细胞克隆数量明显减少(p＜0.001)。<br>　　过表达4T1细胞的IL-6基因，Fibronectin(p＜0.01)、MMP9(p＜0.001)、Snail1(p＜0.01)的mRNA表达量显著增加;在蛋白水平上，IL-6(p＜0.001)、P-STAT3(p＜0.001)、Fibronectin(p＜0.05)、Vimentin(p＜0.001)与P-Smad3(p＜0.001)的表达明显上升;与TGF-β1处理组相比，划痕实验中OEIL-6和TGF-β1共处理组4T1细胞迁移百分比显著增加(p＜0.001);Transwell实验中OEIL-6和TGF-β1共处理组侵袭(p＜0.001)和迁移(p＜0.001)的细胞数量显著下降;与空白对照组相比，SiIL-6处理组4T1细胞的DNA复制活性显著降低(p＜0.001),细胞克隆数量明显减少(p＜0.001)。<br>　　5.6BIO靶向IL-6抑制TGF-β1诱导上皮间质转化的机制研究<br>　　在蛋白水平上，TGF-β1、OEIL-6单独及联合作用均能抑制E-caherin表达，促进Vimentin,P-Smad3表达，且联合作用时对上皮间质转化的诱导作用更显著;而6BIO、SiIL-6促进E-cadherin表达，抑制Vimentin,P-Smad3表达，二者共同作用对上皮间质转化的抑制作用最显著;与TGF-β1和6BIO共处理组相比，TGF-β1+6BIO+SiIL-6处理组E-cadherin表达显著增加（p＜0.001),Vimentin(p＜0.001)、P-Smad3(p＜0.05)表达显著降低，TGF-β1+6BIO+OEIL-6处理组E-cadherin表达明显下降(p＜0.05),Vimentin(p＜0.001)与P-Smad3(p＜0.001)表达显著上升。<br>　　6脂多糖促进TGF-β1诱导BMECs细胞上皮间质转化的机制研究<br>　　利用15ng/mLTGF-β1刺激奶牛乳腺上皮细胞48h,E-cadherin的mRNA表达量显著下降(p＜0.05),N-cadherin、MMP9、Zeb1的mRNA表达量显著上升（p＜0.05);在细胞形态上，TGF-β1促进BMECs细胞由铺路石样向纤长的形态转变;与TGF-β1处理组相比，LPS和TGF-β1共处理组MMP9(p＜0.01)、Snail1(p＜0.01)、Zeb1(p＜0.05)的表达显著增加;敲低BMECs细胞中MMP9基因，与TGF-β1处理组相比，SiMMP9和TGF-β1共处理组中N-cadherin、MMP9、Snail1的表达明显上升(p＜0.05);与LPS处理组相比，SiMMP9和LPS共处理组MMP9、Snail1的表达显著增加(p＜0.05)。<br>　　综上，本研究首次探讨TGF-β1、IL-6诱导小鼠乳腺肿瘤细胞上皮间质转化的机制，解析了6-溴-靛玉红-3''-肟抑制TGF-β1诱导4T1细胞上皮间质转化的分子细节,初步厘清IL-6介导TGF-β1/Smad通路调控上皮间质转化的机理，证明6-溴-靛玉红-3''-肟靶向IL-6抑制TGF-β1诱导上皮间质转化的作用，并进一步探索了牛乳腺上皮细胞上皮间质转化的生物学现象及机制。