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摘要花粉萌发是开花植物完成有性生殖过程的必要环节，它对于保障种子生产和物种特异性至关重要。花粉萌发受众多蛋白因子和细胞学活动调控。然而对调控花粉萌发调控途径的了解尚不完善。ROP是植物体内特有的一类小G蛋白。活性形式的ROP通过激活其下游效应因子来调控植物的极性生长、生物与非生物抗性以及植物激素响应等。花粉萌发过程中ROP快速活化，暗示ROP参与其中，但缺乏遗传学证据。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术同时敲除拟南芥花粉表达的ROP1、ROP3、ROP5和ROP9,并综合细胞学、遗传学、生物化学与分子生物学等手段证实了 ROP信号途径调控花粉萌发。取得的主要研究结果如下:<br>　　(1)rop突变体的创制<br>　　利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制了rop1单突变体、rop3;9双突、rop1;3;9三突和rop1;3;5;9四突突变体。经过序列比对，发现rop1和rop3分别为在第三和第二个外显子上有一个碱基插入;rop5第一个外显子上缺失了 11个碱基;rop9为第二个外显子上有一个碱基缺失，最终均造成翻译提前终止。<br>　　(2)rop1;3;5;9突变体角果败育<br>　　对获得的这些突变体的营养生长进行分析，发现其萌发后三周的小苗和萌发后五周的植株生长状态均正常，但rop1;3;5;9四突角果不结实。正反交实验结果显示，以野生型花粉授rop1;3;5;9柱头时，角果正常结实;而当以rop1;3;5;9四突作为父本，野生型作为母本时，所得角果不结实，表明该突变体的败育属于雄性不育。杂合突变体自交和正反交后代分离比实验结果表明rop1;3;5;9突变体的败育属于配子体遗传。<br>　　(3)rop突变体花粉体外萌发异常<br>　　对野生型花粉和rop1;3;5;9花粉进行亚历山大染色、DAPI染色和扫描电镜观察，结果显示rop1;3;5;9花粉的细胞质形态、细胞核数目及花粉壁发育均正常。此外，花粉黏附与水合实验结果显示rop1;3;5;9花粉在野生型柱头上可以正常黏附、水合。然而，花粉体外萌发实验结果显示rop1;3;5;9完全不萌发;rop1单突和rop3;9双突变体花粉体外萌发速度比野生型慢，但最终可以达到野生型水平;rop1;3;9三突变体体外萌发率降低。在rop1;3;5;9四突变体中引入Lat52:YFP-ROP3,其角果育性恢复。以上结果表明ROP1、ROP3、ROP5和ROP9功能冗余性地调控花粉萌发。<br>　　(4)ROP调控花粉萌发的候选效应因子筛选<br>　　利用Lat52:mRFP-ROP1花序总蛋白进行免疫沉淀和质谱分析找到了 ROP的候选互作蛋白BDR9(Boundary of ROP domain 9)。拟南芥转录组数据库显示其与同家族的BDR8在成熟花粉和花粉管中相对高量表达。qPCR分析和BDR8genomic-GUS与BDR9genomic-GUS转基因材料的GUS组化分析结果显示BDR8和BDR9确实在成熟花粉和花粉管中相对高量表达，暗示BDR8/9可能参与调控花粉萌发。<br>　　(5)ROP与BDR8/9互作<br>　　Split-LUC实验显示ROP1、ROP3、ROP5和ROP9的不同形式(野生型、CA和DN形式)与BDR家族中在花粉和花粉管高量表达的BDR8/9之间均互作。Pull-down实验结果显示BDR8与ROP1及ROP1CA的互作强，与ROP1DN的互作弱，而BDR9与三种形式的ROP1互作强度相当。FRET实验结果表明BDR8/9与ROP的互作发生在细胞膜上。<br>　　本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制rop不同组合的突变体，明确了拟南芥花粉中表达的ROP对花粉萌发的调控。利用免疫沉淀结合质谱分析、生物信息学分析及点对点互作验证找到了ROP调控该过程的候选效应因子BDR8/9。本研究为深入研究ROP信号途径调控花粉萌发奠定了基础，为其在农业生物技术领域的利用提供了更多信息。