KIAA1522上调Notch通路促进结肠癌发展及远处转移并影响患者预后-论文-万方医学网

KIAA1522上调Notch通路促进结肠癌发展及远处转移并影响患者预后

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摘要Notch基因是在对黑腹果蝇研究中命名的一种广泛存在的基因。在多种后生动物中均发现了 Notch的同源物，因此Notch通路被认为是一条古老且高度保守的信号通路，参与多种生物过程如器官形成、组织功能和组织修复等。所以，Notch信号的异常可能导致不良后果。目前在人类结直肠癌组织中，发现了显著上调的Notch配体（DLL1、DLL3、DL4、JAG1和JAG2）和Notch受体（Notch1）的异常激活。这种异常的Notch激活与结直肠癌的不良预后和转移有关，这提示了作为跨膜蛋白的KIAA1522蛋白，很有可能通过调节Notch通路，介导了结肠癌细胞的EMT等形式，从而促进了肿瘤的发展和远处转移。 　　因此我们在前述对KIAA1522与结直肠癌肝转移患者临床病理因素及不良预后分析基础上，以二代测序筛选分析为支点，通过体内和体外实验验证KIAA1522在结肠癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等方面的作用，并通过免疫组化和western blotting等多种方法进一步探究了KIAA1522的表达与Notch信号通路的关系，进一步阐明KIAA1522通过调控Notch通路介导了结肠癌的肿瘤进展和远处转移的可能机制。 　　第一部分 KIAA1522在结直肠癌及其肝转移灶的表达及临床意义 　　目的: 　　结直肠癌是目前世界上常见的预后很差的消化道恶性肿瘤，且具有极高的远处转移率。KIAA1522作为近年来逐渐被熟知和研究的基因，其在结直肠癌中的表达尤其是在结肠癌肝脏转移患者中的表达及临床意义尚不清楚。因此在本研究中，我们通过分析KIAA1522在结直肠癌及其肝脏转移灶中的表达情况，进一步探究KIAA1522的表达与结直肠癌肝转移患者临床病理因素的关系及其对患者预后的影响。 　　方法: 　　我们首先使用了 GEPIA分析了结肠腺癌（COAD）和直肠腺癌（READ）肿瘤样本中KIAA1522的mRNA表达情况以及KIAA1522的表达与患者的远期生存和无瘤生存的关系，并分析了 KIAA1522与典型的增殖标记物MKI67在结肠腺癌和直肠腺癌的肿瘤样本中的表达水平的相关性。然后通过一系列纳入和排除标准，我们回顾性收集了从2005年1月至2016年1月在山东大学齐鲁医院因结直肠癌及其肝脏转移癌接受手术并有术后病理切片标本的57名患者纳入本次回顾性分析研究。通过免疫组化方法检测KIAA1522表达，并将KIAA1522在结直肠癌原发灶中的表达和其在肝转移灶中的表达分别与患者的临床病理因素应用单因素分析进行了统计分析。采用Kaplan-Meier法绘制了患者的生存曲线，采用COX单因素检验比较患者生存率的差异，分析影响患者预后的独立风险因素，探究KIAA1522在结直肠癌肝转移患者中的临床意义。 　　结果: 　　GEPIA分析发现，与非肿瘤样本相比，结肠腺癌（COAD）和直肠腺癌（READ）肿瘤样本中KIAA1522的mRNA表达显著上调。GEPIA中的生存分析表明，KIAA1522的高表达的结肠腺癌患者的无瘤生存率较低。KIAA1522与典型的增殖标记物MKI67在结肠腺癌和直肠腺癌的肿瘤样本中的表达水平呈正相关。 　　我们通过对KIAA1522表达情况的分析对比发现，KIAA1522在结直肠癌原发灶中的表达与其在对应的肝脏转移灶中的表达呈显著正相关性。结直肠癌原发灶中KIAA1522的表达与结直肠癌肿瘤T分期及肿瘤静脉侵犯有关，说明结直肠癌原发灶中KIAA1522的高表达预示着更差的肿瘤分期以及更多的局部血管侵犯。而肝转移灶中KIAA1522的表达与最大肝转移灶的直径有关，这表明肝脏转移灶中KIAA1522的高表达预示了更快速的转移灶增殖能力。 　　在对生存相关的分析中我们发现，KIAA1522在结直肠癌原发灶中的表达与患者的总生存期存在显著统计学相关性，但与无瘤生存率无统计学相关性。多因素回归分析结果表明KIAA1522在结直肠癌原发灶中的高表达以及静脉侵犯被证实是结直肠癌患者术后远期生存的独立危险因素。 　　结论: 　　1.KIAA1522在结直肠癌原发灶和肝脏转移灶的表达具有相关性。 　　2.KIAA1522在结直肠癌原发灶的表达与肿瘤分期、局部静脉侵犯有关,而KIAA1522在肝脏转移灶的表达则与转移灶肿瘤的大小相关。 　　3.KIAA1522在结直肠癌原发灶的表达是结直肠癌肝脏转移患者术后生存的独立危险因素，其表达水平与患者的远期生存呈负相关。 　　第二部分 KIAA1522上调Notch通路促进结肠癌细胞增殖侵袭和远处转移 　　目的: 　　通过第一部分的研究和分析，我们预测KIAA1522作为结直肠癌肝转移患者的预后标志物，促进了结直肠癌的发展和远处转移，但其调控机制尚未明确。在本部分，我们探究KIAA1522与Notch信号转导通路之间的相关性，探讨KIAA1522对Ntoch通路的调控作用以及这种调控对结肠癌细胞增殖、侵袭和远处转移的影响。 　　方法: 　　在本部分实验中，我们首先对不同的结肠癌细胞系的KIAA1522表达进行了筛选并验证了转染siRNA以及过表达质粒的有效性。在体外实验层面，我们通过CCK-8实验、集落形成实验、流式细胞技术、Transwell实验和划痕试验等验证了 KIAA1522在结肠癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等方面的促癌作用。然后我们通过裸鼠皮下荷瘤模型和尾静脉注射转移模型，在体内实验层面验证了 KIAA1522促进结肠癌细胞肿瘤形成及其远处转移的作用。为了进一步探讨KIAA1522可能的调节通路，我们通过二代测序技术，对差异表达K1AA1522的结肠癌细胞系的下游信号通路进行了对比筛选和分析，确定出KIAA1522可能调控的下游信号通路。并通过western blotting及免疫组化分析方法对细胞学及体内实验标本的进一步分析，探究了 KIAA1522的表达与Notch信号通路的表达相关性，从而进一步阐明KIAA1522可能通过上调Notch信号通路促进结直肠癌增殖、侵袭和远处转移的信号机制。 　　结果: 　　所选的三种细胞系:SW480、LOVO、HCT116均有KIAA1522的表达，与SW480细胞相比，HCT116和LOVO细胞的KIAA1522表达量较高。KIAA1522敲低后，HCT116细胞凋亡较对照组增加，而过表达KIAA1522后，SW480细胞凋亡较对照组减少。在KIAA1522沉默后，HCT116细胞系中凋亡相关蛋白Bax水平升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2水平下降，在过表达KIAA1522的SW480细胞系中观察到相反的结果。CCK-8检测实验和集落形成实验的结果显示与对照组相比，KIAA1522的沉默导致了HCT116细胞生长受到抑制、集落形成率减少，而KIAA1522过表达情况下则呈现相反结果。在体内实验中，KIAA1522的沉默可以抑制结肠癌HCT116细胞的增殖，从而进一步说明KIAA1522在促进结直肠癌的进展中可能发挥了重要作用。 　　Transwell实验结果显示，与各自的对照组相比，沉默KIAA1522的表达后，HCT116细胞的跨膜迁移和侵袭能力下降，而在上调了KIAA1522的表达后，SW480细胞的跨膜迁移和侵袭能力增强。划痕实验的结果表明与对照组相比，下调KIAA1522的表达可以降低HCT116细胞的迁移能力，而在上调KIAA1522的表达后，SW480细胞的迁移能力较对照组提高。体内实验发现，注射K1AA1522沉默稳转株细胞的小鼠比注射对照细胞的小鼠发生的肺转移更少，两组间肺转移结节数量差异有统计学意义。 　　二代测序以及GSEA分析发现在KIAA1522过表达组中与Notch信号通路相关的基因呈现显著富集态势。随后的GEPIA数据库分析发现在结肠腺癌和直肠腺癌病例组织样本中，KIAA1522的表达与Notch信号通路中的关键基因的表达呈现正相关性。进一步实验发现，在KIAA1522下调的细胞中，Notch通路关键蛋白水平下降，而在KIAA1522上调的细胞中，这些蛋白表达水平升高。表明了 KIAA1522通过上调Notch信号转导通路促进结直肠癌的发生、发展和远处转移。 　　结论: 　　1.KIAA1522在结肠癌细胞系中对结肠癌细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移均起作用。 　　2.KIAA1522在裸鼠中促进了结肠癌细胞的荷瘤增殖以及远处转移。 　　3.KIAA1522可能通过上调Notch信号通路的表达促进结肠癌的增殖侵袭和远处转移，因此KIAA1522有希望成为结肠癌肝脏转移的潜在治疗靶点。