检索历史 清除

摘要研究背景、目的:<br>　　椎间盘退变(intervertebraldiscdegeneration,IVDD)被认为是各种脊柱退变性疾病的病理基础，是发生腰背痛(lowbackpain,LBP)的最主要原因，严重影响生活质量。目前相应治疗手段有很多，但由于对IVDD的具体发病机制尚不明确，治疗效果都不理想。许多研究表明，脂肪来源的间充质干细胞(adipose-derivedmessenchymalstemcells,ADSCs)可在特定条件下快速增殖并分化为髓核样细胞，从而维持椎间盘(inervertebraldisc,IVD)功能，在干细胞移植治疗IVDD方面展现出巨大潜力。同时各种生物材料已被评估为组织再生、药物输送和临床应用的重要候选，基于干细胞移植的生物材料如水凝胶、纳米粒子等已被证实具有修复IVDD的可能性。然而，由于退变的椎间盘内部处于缺氧和炎症环境中，使得干细胞在经移植后很难存活，同时由于生物材料与宿主免疫系统之间的相互作用，植入材料引起的局部炎症反应同样严重干扰干细胞的分化方向。因而急需制定特殊策略来提高干细胞移植后的成活率和分化效率，增强生物材料对间充质干细胞治疗IVDD的临床效果。<br>　　促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)作为一种调节造血的激素，已被证实可增强间充质干细胞活性，促进其成骨分化。基于上述问题，我们设计了一种可负载促红细胞生成素的多孔微球材料，它对ADSCs具有较强的粘附性，并可缓释EPO。在本研究中,我们通过体外实验证实这种微球可帮助ADSCs更好地吸收EPO,提高EPO对ADSCs的活性增强作用和促分化能力，并通过构建大鼠尾椎间盘退变模型，证实经载EPO微球(EPO-loadedmicrospheres,E-MP)强化后的ADSCs对IVDD有更好的治疗效果。<br>　　研究方法:<br>　　在体外实验中，我们首先采用CCK-8法找到对ADSCs活性提高作用最大的EPO浓度;然后，采用CalceinAM/PI染色、Hoechst染色、流式细胞技术、DCFH-DA探针及JC-1探究载EPO微球对ADSCs在200μMH2O2条件下的细胞活性的影响及对线粒体的保护作用;分别采用qPCR或WesternBlotting(WB)技术检测载EPO微球对ADSCs产生的炎症相关分子、凋亡相关分子、细胞外基质分子及髓核样细胞标志分子的表达水平的影响;最后采用WesternBlotting、流式细胞技术及JC-1染色探究了经E-MP强化后的ADSCs对髓核细胞(nucleuspulposuscells,NPCs)在低氧环境下的保护作用。<br>　　在体内实验中，我们通过尾椎间盘穿刺法构建大鼠尾椎间盘退变模型，并设置对照,通过X线及MRI影像对比ADSCs及经E-MP强化后的ADSCs治疗椎间盘退变4周及8周的效果。之后对大鼠尾椎间盘作处理并制作标本切片，进行HE及番红O-固绿染色。最后通过免疫组化技术来检测经强化后ADSCs对大鼠椎间盘基质成分CollagenⅡ和Aggrecan的恢复作用。<br>　　研究结果:<br>　　体外实验中，通过CCK-8检测结果可知最适ADSCs生长的EPO浓度为10IU/mL;CalceinAM/PI染色、Hoechst染色和流式细胞术结果证实在200μMH2O2刺激下，经E-MP处理后的ADSCs相较于EPO(10IU/mL)和单纯微球处理后的ADSCs存活率更高;活性氧染色实验及JC-1实验证实E-MP可以更好地保护低氧环境下ADSCs的线粒体;qPCR实验结果显示E-MP组的ADSCs相较于其他组在H2O2刺激下的炎症及基质降解相关分子(COX2、Adamts5和MMP13)表达更低，而髓核细胞标志分子则表达增高;WesternBlotting实验结果证实E-MP可以显著抑制低氧环境下ADSCs中Caspase-3、Bax、COX2、Adamts5和MMP13、P65和Ikb-α的蛋白表达，提高抗凋亡蛋白(Bcl-2)、髓核内基质蛋白(CollagenⅡ)、髓核样细胞标志蛋白(Sox9、Krt19和Shh)的表达;同时我们通过共培养实验证明了经E-MP强化后的ADSCs相较于未作处理的ADSCs可以更好地保护NPCs在低氧环境下的活性和线粒体膜电位。<br>　　体内实验中，我们成功构建大鼠尾椎间盘退变模型，通过X线及MRI影像证实在对退变椎间盘注射经E-MP强化后的ADSCs后退变程度有所恢复;H&E染色、番红O-固绿染色及CollagenⅡ和Aggrecan的免疫组化染色结果显示经E-MP强化后的ADSCs相较于普通ADSCs可以更好地修复退变的椎间盘。<br>　　结论:载EPO微球可以显著地增强ADSCs的活性，抑制ADSCs炎症反应，保护其线粒体不受氧化应激损害，促进ADSCs向髓核样细胞分化，还能提高ADSCs对NPCs的保护能力，并在体内发挥最好的修复椎间盘退变的作用，为干细胞治疗IVDD提供了新的、更有效的策略。