胎盘滋养细胞来源外泌体miRNA在妊娠期糖尿病介导的胎儿肺发育不良中的作用机制研究-论文-万方医学网

胎盘滋养细胞来源外泌体miRNA在妊娠期糖尿病介导的胎儿肺发育不良中的作用机制研究

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摘要背景与目的: 　　妊娠期糖尿病(gestationaldiabetesmellitus,GDM)是妊娠期间首次发生或发现的葡萄糖代谢异常，在世界范围内的发病率为6.1％-15.2％,已成为最常见的妊娠期并发症之一。近年来，随着我国经济的发展，人民生活水平的提高以及二胎政策放开后高龄孕产妇的增多，GDM的发病率也呈现出逐年上升的趋势。GDM会对母亲和胎儿造成很多短期和长期的不良影响，其中GDM介导的胎儿肺发育不良已成为导致新生儿及幼儿严重呼吸系统疾病的重要因素之一，明确其致病机制显得尤为重要。 　　胎盘作为母亲和胎儿之间的天然界面，合成并分泌众多激素，细胞因子和化学物质,对维持胎儿正常的生长发育发挥了重要的作用。当患者罹患妊娠期糖尿病时，受到高糖等不良宫内环境刺激的影响，胎盘也会做出适应性的变化参与到炎症反应，氧化应激，内分泌反应等病理生理过程中，进而影响到胎儿的正常生长发育。既往研究已经证实了胎盘功能障碍在新生儿肺发育不良中的决定性作用，但处于异常状态的胎盘尤其是其中的滋养细胞在GDM介导的胎儿肺发育不良中的作用尚未得到完全阐明。 　　外泌体(Exosomes)作为细胞间信息通讯的重要载体，在正常生理和病理过程中的作用日益受到广泛关注，其可以携带亲本细胞的各种遗传物质以及活性分子到达受体细胞，进而调控受体细胞的基因表达并影响其生物学功能。近年来，胎盘滋养细胞来源外泌体已被证明在正常妊娠和病理妊娠中均发挥着重要的作用，但大多数研究主要聚焦于对母体相关细胞比如血管内皮细胞，平滑肌细胞，单核细胞等的影响，尚未见有报道胎儿血循环中胎盘滋养细胞来源外泌体的存在以及胎盘滋养细胞来源外泌体对胎儿发育尤其是肺发育过程调控相关的研究。 　　MicroRNA(miRNA)是由长度约22个核苷酸组成的在物种间具有高度保守性的非编码RNA,其主要功能是通过直接结合下游mRNA的3''非翻译区(3''UTR)抑制其表达,进而影响靶细胞的生物学功能。作为外泌体内容物的主要组成成分，exosomal-miRNA介导的细胞间通讯在各种疾病的发生发展中已被证实具有重要意义，且已有大量研究证实了miRNA在胎儿肺发育过程中具有重要的调控作用，但是胎盘滋养细胞外泌体来源的miRNA在胎儿肺发育中的作用尚未明确。 　　因此，本研究旨在从脐血血浆中胎盘滋养来源外泌体介导的“胎盘-肺”通讯的角度出发，通过分离纯化GDM患者脐血血浆中胎盘滋养来源外泌体以及体外构建GDM滋养细胞模型来源外泌体，利用A549人肺泡上皮细胞体外模型，孕鼠胚胎肺外植体体外培养模型和孕鼠外泌体羊膜腔注射体内模型来系统观察GDM相关外泌体介导胎儿肺发育不良的作用;之后通过高通量测序技术和qRT-PCR验证,筛选出差异表达的miRNA并通过构建miRNA过表达的外泌体模型，进一步探究胎盘滋养细胞来源外泌体调控胎儿肺发育的分子机制，以期能进一步提高对GDM介导的胎儿肺发育不良机制的认识并为其防治提供新的作用靶点和思路。 　　第一部分:脐血血浆中胎盘滋养细胞来源外泌体及体外滋养细胞模型来源外泌体的提取与鉴定 　　研究方法 　　1.使用蔗糖密度梯度离心联合超速离心法提取脐血血浆中胎盘滋养细胞来源外泌体。 　　2.通过在人早孕期绒毛外滋养细胞系HTR8/SVneo培养基中添加25mM高糖来构建GDM滋养细胞模型，收集细胞培养上清后应用超速离心法提取外泌体。 　　3.应用透射电子显微镜(TEM)、纳米粒子示踪技术(NTA)和WesternBlot技术对外泌体进行鉴定及分析。 　　研究结果 　　1.成功分离提取正常与GDM患者脐血血浆中胎盘滋养细胞来源外泌体(NUB-exos与GDMUB-exos)与正常和GDM滋养细胞来源外泌体(NC-exos与HG-exos)。 　　2.上述各组外泌体均呈现典型的杯状双层膜结构,直径均在30-200nm范围内且WB结果提示均表达外泌体标志蛋白CD63,TSG101以及胎盘特异性蛋白PLAP,NTA结果显示GDMUB-exos以及HG-exos分别比NUB-exos以及NC-exos的浓度升高。 　　研究结论 　　脐血血浆中存在胎盘滋养细胞来源外泌体，且临床样本及体外GDM滋养细胞模型均证明高糖可以促进外泌体的生成和释放。 　　第二部分:GDM胎盘滋养细胞来源外泌体介导胎儿肺发育不良的作用研究 　　研究方法 　　1.A549人肺泡上皮细胞体外模型:首先将用PKH67荧光染料标记的各组外泌体进行外泌体内化实验来观察外泌体是否能够被A549细胞内化。之后通过细胞增殖毒性实验(cellcountingkit-8,CCK-8)检测细胞活力，EdU细胞增殖实验检测细胞及增殖，流式细胞术检测细胞凋亡比例，WesternBlot和qRT-PCR检测不同来源外泌体处理后肺泡表面活性物质相关蛋白SPA、SPB、SPC和SPD(surfacantproteinsA、B、C和D)的表达变化。此外，还通过WesternBlot检测了凋亡相关蛋白Bax、Bcl2、Bim和Cleaved-caspase3的表达变化。 　　2.孕鼠胚胎肺外植体体外培养模型:首先分离孕E11.5孕鼠胚胎肺进行体外培养72h,培养过程中加入不同组外泌体，通过拍照计算胚胎肺外植体终末分支数和表面积来评估胎鼠肺外植体的生长发育情况。收集肺外植体后固定切片，应用EdU和Tunel实验检测增殖和凋亡细胞比例变化。WesternBlot检测不同来源外泌体处理后SOX9、肺泡表面活性物质相关蛋白SPA、SPB、SPC和SPD(surfacantproteinsA、B、C和D)和凋亡相关蛋白Bax、Bcl2、Bim和Cleaved-caspase3的表达变化。qRT-PCR检测了不同来源外泌体处理后肺泡表面活性物质相关蛋白SPA、SPB、SPC和SPD(surfacantproteinsA、B、C和D)和肺发育相关基因Fgf10、VEGFa、Kdr和Flt-1的表达变化。最后还利用组织切片免疫荧光染色进一步检测了与II型肺泡上皮细胞分化相关的肺泡表面活性物质相关蛋白C(SurfactantProteinC,SPC)的表达变化情况。 　　3.孕鼠外泌体羊膜腔注射体内模型:首先我们在孕E14.5天对孕鼠行羊膜腔注射不同组外泌体，后于孕18.5天行剖宫产收取胎鼠，统计胎鼠体重和头臀长。后解剖胎鼠肺组织，固定切片后行HE染色，应用辐射状肺泡计数(radialalveolarcount,RAC)和肺表面组织密度评估胎肺发育情况。WesternBlot检测不同来源外泌体处理后肺泡表面活性物质相关蛋白SPA、SPB、SPC和SPD(surfacantproteinsA、B、C和D)和凋亡相关蛋白Bax、Bcl2、Bim和Cleaved-caspase3的表达变化。qRT-PCR检测了不同来源外泌体处理后肺泡表面活性物质相关蛋白SPA、SPB、SPC和SPD(surfacantproteinsA、B、C和D)和肺发育成熟相关基因BMP2、BMP4和ID1的表达变化。将胎鼠肺组织切片通过EdU和Tunel实验检测增殖和凋亡细胞比例变化;最后还利用组织切片免疫荧光染色进一步检测了与II型肺泡上皮细胞分化相关的肺泡表面活性物质相关蛋白C(SurfactantProteinC,SPC)的表达变化情况。 　　研究结果 　　1.在A549人肺泡上皮细胞体外模型中，PKH67标记的各组外泌体均能够被A549细胞内化。分别与NUB-exos组和NC-exos组相比，A549细胞加入GDMUB-exos组和HG-exos组处理后，细胞活性和增殖能力降低，凋亡比例升高。WesternBlot和qRT-PCR结果显示肺泡表面活性物质相关蛋白SPA、SPB、SPC和SPD(surfacantproteinsA、B、C和D)和抑制凋亡相关蛋白Bcl2的表达降低，促凋亡相关蛋白Bax、Bim和Cleaved-caspase3的表达升高。 　　2.在孕鼠胚胎肺外植体体外培养模型中，分别与NUB-exos组和NC-exos组相比，胚胎肺外植体加入GDMUB-exos组和HG-exos组处理后，统计结果显示终末分支数显著减少伴随着表面积的降低。EdU和Tunel实验结果表明增殖细胞比例降低而凋亡细胞比例升高;WesternBlot和qRT-PCR结果显示肺泡表面活性物质相关蛋白SPA,SPB,SPC和SPD在转录和转录后水平均明显降低，与此同时抑制凋亡相关蛋白Bcl2表达降低而促凋亡相关蛋白Bax、Bim和Cleaved-caspase3的表达均明显升高。此外，与肺发育相关的关键基因Fgf10、VEGFa、Kdr和Flt-1的表达明显降低。最后组织切片免疫荧光染色显示肺泡表面活性物质相关蛋白C(SurfactantProteinC,SPC)的表达降低。 　　3.在孕鼠外泌体羊膜腔注射体内模型中:分别与NUB-exos组和NC-exos组相比，GDMUB-exos组和HG-exos组处理后，胎鼠体重和头臀长均明显减少。HE染色结果显示辐射状肺泡计数(radialalveolarcount,RAC)降低而肺表面组织密度升高。WesternBlot和qRT-PCR结果显示肺泡表面活性物质相关蛋白SPA、SPB、SPC和SPD在转录和转录后水平均明显降低，与此同时抑制凋亡相关蛋白Bcl2表达降低而促凋亡相关蛋白Bax、Bim和Cleaved-caspase3的表达均明显升高。此外，与肺发育成熟相关的基因BMP2、BMP4和ID1的表达明显降低。最后组织切片免疫荧光染色显示肺泡表面活性物质相关蛋白C(SurfactantProteinC,SPC)的表达降低。 　　研究结论 　　GDM胎盘滋养细胞来源外泌体会破坏肺泡上皮细胞稳态，抑制增殖而促进凋亡，降低肺泡表面活性物质的表达，损坏肺分支形态发生，延缓胎儿肺发育，导致胎儿肺发育不良。 　　第三部分:GDM患者脐血血浆中胎盘来源外泌体差异性miRNA的筛选和验证 　　研究方法 　　1.应用高通量测序技术对GDM患者脐血血浆中胎盘来源外泌体miRNAs表达谱进行分析，筛选差异表达的miRNAs。 　　2.应用TargetScan和miRanda在线网站预测差异表达的miRNAs的靶基因，对靶基因进行基因本体(GeneOntology,GO)分析和京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,KEGG)富集分析。 　　3.通过qRT-PCR验证胎盘滋养细胞来源外泌体中差异表达的miRNAs。 　　研究结果 　　1.高通量测序结果显示共检测到1885个miRNAs,其中有55个差异表达的miRNAs(10个miRNAs表达上调，45个miRNAs表达下调)。 　　2.对差异表达的miRNAs进行靶基因预测，对预测的靶基因进行GO富集分析发现靶基因主要富集于蛋白结合，转移酶活性，ATP结合，细胞周期等信号通路。进行KEGG分析发现靶基因主要富集于PI3K-AKT信号通路,癌症通路,钙通路,Rab1通路和Hippo通路。 　　3.通过qRT-PCR实验确定miR-185-5p为下一步研究对象。 　　研究结论 　　正常和GDM患者脐血血浆中胎盘滋养细胞来源外泌体具有不同的miRNAs表达谱。 　　第四部分:GDM患者胎盘滋养细胞来源外泌体miR-185-5p介导胎儿肺发育不良的作用机制研究 　　研究方法 　　1.应用慢病毒载体构建稳定过表达miR-185-5p的HEK-293T细胞系，收集细胞培养上清，应用超速离心法提取外泌体后通过TEM、NTA和WesternBlot对外泌体进行鉴定。之后应用qRT-PCR检测293T细胞及其细胞培养上清外泌体中miR-185-5p的表达情况。 　　2.A549人肺泡上皮细胞体外模型:首先将用PKH67荧光染料标记的各组外泌体进行外泌体内化实验来观察外泌体是否能够被A549细胞内化。之后通过细胞增殖毒性实验(cellcountingkit-8,CCK-8)检测细胞活力，EdU细胞增殖实验检测细胞及增殖，流式细胞术检测细胞凋亡比例，WesternBlot检测不同来源外泌体处理后肺泡表面活性物质相关蛋白SPA、SPB、SPC和SPD(surfacantproteinsA、B、C和D)的表达变化。 　　3.孕鼠胚胎肺外植体体外培养模型:首先分离孕E11.5孕鼠胚胎肺进行体外培养72h,培养过程中加入不同组外泌体，通过拍照计算胚胎肺外植体终末分支数和表面积来评估胎鼠肺外植体的生长发育情况。收集肺外植体后固定切片，应用EdU和Tunel实验检测增殖和凋亡细胞比例变化。WesternBlot检测不同来源外泌体处理后肺泡表面活性物质相关蛋白SPA、SPB、SPC和SPD(surfacantproteinsA、B、C和D)的表达变化。 　　4.孕鼠外泌体羊膜腔注射体内模型:首先我们在孕E14.5天对孕鼠行羊膜腔注射不同组外泌体，后于孕18.5天行剖宫产收取胎鼠。后解剖胎鼠肺组织，固定切片后行HE染色，应用辐射状肺泡计数(radialalveolarcount,RAC)和肺表面组织密度评估胎肺发育情况。应用EdU和Tunel实验检测增殖和凋亡细胞比例变化。WesternBlot检测不同来源外泌体处理后肺泡表面活性物质相关蛋白SPA、SPB、SPC和SPD(surfacantproteinsA、B、C和D)。 　　5.应用TargetScan和miRDB预测miR-185-5p靶基因，双荧光素酶报告基因实验进一步验证miR-185-5p与靶基因SOX13/Sox13的靶向调控关系。WesternBlot及qRT-PCR检测SOX13/Sox13、β-catenin通路蛋白变化情况。 　　研究结果 　　1.成功构建miR-185-5p过表达的HEK-293T细胞并提取外泌体，两组外泌体均呈现典型的杯状双层膜结构，直径均在30-200nm范围内且WB结果提示均表达外泌体标志蛋白CD63,TSG101,CD9,以及内质网膜蛋白Calnexin表达阴性。qRT-PCR结果显示过表达miR-185-5pde293T细胞及其细胞上清液外泌体中miR-185-5p的表达均明显升高。 　　2.在A549人肺泡上皮细胞体外模型中，PKH67标记的两组外泌体均能够被A549细胞内化。与对照组相比，加入过表达miR-185-5p外泌体后，细胞活性和增殖能力降低，凋亡比例升高。WesternBlot和qRT-PCR结果显示肺泡表面活性物质相关蛋白SPA、SPB、SPC和SPD(surfacantproteinsA、B、C和D)。 　　3.在孕鼠胚胎肺外植体体外培养模型中，与对照组相比，胚胎肺外植体加入过表达miR-185-5p外泌体后，统计结果显示终末分支数显著减少伴随着表面积的降低。Edu和Tunel实验结果表明增殖细胞比例降低而凋亡细胞比例升高.WesternBlot显示肺泡表面活性物质相关蛋白SPA,SPB,SPC和SPD表达降低. 　　4.在孕鼠外泌体羊膜腔注射体内模型中:HE染色结果显示辐射状肺泡计数(radialalveolarcount,RAC)降低而肺表面组织密度升高。Edu和Tunel实验结果表明增殖细胞比例降低而凋亡细胞比例升高。WesternBlot结果显示肺泡表面活性物质相关蛋白SPA、SPB、SPC和SPD明显降低。 　　5.应用生物信息学预测到SOX13/Sox13在人和小鼠中为miR-185-5p的同源靶基因,后通过双荧光素酶报告基因实验进一步证实两者结合位点，WesternBlot结果表明经过miR-185-5p过表达外泌体处理后，SOX13/Sox13和β-catenin的表达量明显降低。 　　研究结论 　　GDM胎盘滋养细胞来源外泌体来源miR-185-5p可以通过靶向SOX13(Sox13)/β-catenin通路介导胎儿肺发育不良的发生。