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摘要早发性卵巢功能不全(Prematureovarianinsufficiency,POI)是指女性40岁之前出现卵巢功能减退，是一种难防难治的生殖障碍性疾病。POI的发病率约为3.7％,呈上升趋势，严重影响着女性的身心健康。大多数女性患者临床就诊时卵巢功能已经发生不可逆转的衰竭，但目前尚无有效的治疗策略改善或恢复卵巢功能。因此，POI的病因学研究对于其早期预警、诊断和干预具有重要意义。POI的病因高度异质，包括遗传缺陷、自身免疫异常、感染、医源性因素以及环境因素等，然而约半数的POI患者病因仍不明确。因此，通过遗传学筛查明确病因并探索POI的发病机制，是实现POI早诊早治的关键。<br>　　转录因子p63基因(在人类中命名为TP63)是p53家族成员之一，其编码的TAp63α蛋白亚型特异性地表达于原始卵泡的卵母细胞中。在生理情况下，TAp63α的C端转录抑制结构域(Transactivationinhibitorydomain,TID)和N端转录激活结构域(Transcriptionalactivationdomain,TAD)相互结合，形成失活的封闭二聚体。当卵母细胞发生DNA损伤时，TAp63α发生磷酸化，从失活型二聚体变为激活型四聚体，从而诱导细胞凋亡，起到卵母细胞质量控制因子的功能,从而维持女性生殖细胞的基因组完整性。在既往研究中，少数病例报道发现TP63突变可能通过影响TAp63α的功能导致POI的发生。但存在样本量小、表型差异大且缺乏系统功能研究等局限性，该基因变异对POI的遗传贡献度以及基因型与表型的相关性仍缺乏大样本临床证据和机制研究的支持。<br>　　目的<br>　　阐明TP63基因突变在POI发病中的作用及分子机制。<br>　　方法<br>　　首先，基于课题组前期构建的1030例POI-全外显子组测序(Wholeexonsequencing,WES)数据库，对TP63基因进行突变筛查、验证、致病性预测及突变位置分析;在SAOS-2细胞(人骨肉瘤细胞系，无内源性TP63基因表达)中过表达野生型与突变型TAp63α质粒，行Westernblot、BN-PAGE检测野生型与突变型TAp63α蛋白的表达及聚合状态，并通过Co-IP实验检测突变型TID与TAD的结合变化，明确突变型TAp63α蛋白聚合状态改变的原因;进一步行双荧光素酶报告实验、凋亡相关蛋白BAX和TUNEL检测，比较野生型与突变型TAp63α的转录活性及对SAOS-2细胞凋亡的影响，明确突变对TAp63α活性和功能的影响。<br>　　为了进一步明确TP63基因功能缺陷在POI发生中的作用机制，我们首先构建了TID缺失(p63+/ΔTID)小鼠，通过对p63+/ΔTID小鼠的生育力及生殖系统表型进行观察，明确TID缺失对雌性生殖系统的影响;同时，对p63+/ΔTID小鼠卵巢行凋亡标志物Cleaved-PARP1的免疫荧光染色，Westernblot检测凋亡蛋白BAX的表达水平，qRT-PCR检测凋亡相关靶基因Puma及Noxa的mRNA表达水平，明确TID缺失的小鼠卵母细胞是否通过凋亡途径迅速耗竭;在SAOS-2细胞中分别转染小鼠野生型p63和突变型p63ΔTID质粒，检测p63蛋白的表达水平、聚合状态以及对下游凋亡相关靶基因转录的作用，进一步揭示p63ΔTID发挥作用的机制。<br>　　最后，为了明确源于临床患者的TP63基因点突变的致病性，我们构建了TID点突变(p63+/R647C)小鼠，通过对p63+/R647C小鼠的生育力及生殖系统表型进行观察，确定TID点突变对雌性生殖系统的影响;同时，通过对p63+/R647C小鼠卵巢凋亡标志物Cleaved-PARP1的免疫荧光染色，明确TID点突变小鼠卵母细胞是否通过凋亡途径耗竭;此外，由于p63+/R647C小鼠生殖缺陷表型轻于p63+/ΔTID小鼠，通过观察p63+/R647C小鼠卵母细胞的第一极体排出率、纺锤体形态(α-tubulin的免疫荧光染色)、线粒体膜电位(JC-1染色)，进一步评估点突变小鼠幸存卵母细胞的质量。<br>　　结果<br>　　1.TP63基因突变筛查及体外功能研究<br>　　在1030例POI患者中发现11名患者携带9个TP63基因杂合突变p.S285N、p.T538A、p.T567I、p.Q568fs*3、p.R594*、p.R643Q、p.L646P、p.R647C和p.R655Q,并通过Sanger测序验证。其中大部分突变位于TAp63α的C端，包括导致TID功能域丢失的截短突变(p.Q568fs*3、p.R594*)和位于TID核心序列内的点突变(p.R643Q、p.L646P、p.R647C和p.R655Q)。这些突变位点在物种间高度保守，多种软件预测为可能致病变异。<br>　　在SAOS-2细胞中过表达野生型与突变型TAp63α质粒，发现影响TID功能域的6个突变型蛋白(p.Q568fs*3、p.R594*、p.R643Q、p.L646P、p.R647C和p.R655Q)由失活的二聚体构象转变为活性四聚体。其中，p.Q568fs*3、p.R594*直接导致TID的缺失，而p.R643Q、p.L646P、p.R647C和p.R655Q突变体损害了TID与N端TAD的结合作用。同时，这6个TID受损的突变体激活了下游凋亡相关靶基因NOXA、PUMA和BAX的表达，导致细胞凋亡增加。这些结果提示影响TID功能的突变具有致病性。<br>　　2.p63+/ΔTID小鼠POI样表型分析及相关机制研究<br>　　成年p63+/ΔTID雌鼠完全不育，卵巢萎缩。卵巢组织HE染色结果显示，出生后1天(P1)p63+/ΔTID小鼠卵泡大量丢失。卵泡计数结果表明，胚胎18.5天(E18.5)时p63+/ΔTID小鼠卵母细胞数量与野生型小鼠相比没有明显差异，而P1时数量减少至野生型小鼠的约40％,P10时完全丢失。<br>　　进一步分析P1p63+/ΔTID小鼠卵巢中卵母细胞的凋亡情况，免疫荧光染色结果显示p63+/ΔTID小鼠卵巢中Cleaved-PARP1阳性的卵母细胞比例显著增加。同样，Westernblot和qRT-PCR检测结果表明，p63+/ΔTID小鼠卵巢中Bax蛋白表达增加，Puma和Noxa的mRNA水平升高。此外，通过BN-PAGE检测到在SAOS-2细胞中过表达的p63ΔTID突变体形成活化四聚体，双荧光素酶报告实验结果显示p63ΔTID激活下游PUMA、NOXA和BAX基因的转录。<br>　　3.p63+/R647C小鼠POI样表型分析及相关机制研究<br>　　成年p63+/R647C雌鼠生育力下降，卵巢体积明显减小。卵巢组织HE染色结果显示，p63+/R647C小鼠卵巢中卵泡大量丢失，P10p63+/R647C小鼠卵母细胞减少至野生型小鼠的约50％。<br>　　进一步行Cleaved-PARP1免疫荧光染色，结果显示p63+/R647C小鼠卵母细胞凋亡比例显著增加。同时，除了在p63+/R647C小鼠中观察到卵母细胞丢失外，其剩余的存活卵母细胞第一极体排出率降低，异常纺锤体率增高且线粒体膜电位下降，提示卵母细胞质量受损。<br>　　结论<br>　　本研究基于大样本临床病例突变筛查和系统性体内外功能研究，揭示了TP63基因功能获得性突变导致TAp63α蛋白C端的TID功能受损，引起TAp63α蛋白异常激活，导致卵母细胞病理性凋亡并最终发展为POI的分子机制，为女性特别是肿瘤放化疗患者的生育力保护提供了理论依据和干预靶点。