CHK1基因突变导致患者卵裂障碍的致病机制与干预研究-论文-万方医学网

CHK1基因突变导致患者卵裂障碍的致病机制与干预研究

二维码有效期 120s

收藏纠错

摘要成熟的卵母细胞与获能的精子融合后形成受精卵，代表着人类生物学生命的开始,随后受精卵经历几次连续的的有丝分裂和分化形成囊胚，植入子宫以建立正常妊娠，以上任何过程发生异常均可导致不孕。近年来曾先后报道多个导致人卵母细胞成熟障碍、受精障碍、早期胚胎发育阻滞等不孕类型的致病基因，但是受精卵分裂障碍（卵裂障碍）患者的致病基因鲜有报道，更无有效治疗方法。 　　为鉴定患者卵裂障碍的致病基因并解析其致病机制，本研究第一章中，我们收集卵裂障碍的不孕患者和家系进行全外显子组测序，经过系列位点筛选与验证后，鉴定到CHK1基因的致病突变;深入机制研究表明这些突变可能影响CHK1蛋白结构，改变蛋白核质定位，导致CHK1激酶活性升高，通过CDC25C/CDK1通路引起细胞周期阻滞,从而使患者表现为卵裂障碍，这为卵裂障碍患者的诊断提供了新的分子靶标。考虑到携带CHK1致病突变的患者还伴有明显的原核核膜破裂障碍，为深入探讨其可能机制，本研究第二章中，我们通过患者受精卵的核质互换与单细胞转录组测序分析发现CHK1突变受精卵内F-肌动蛋白网络破坏，突变CHK1蛋白可能通过改变与MICAL3蛋白之间的互作而影响后者的酶活从而导致F-肌动蛋白解聚，影响原核核膜破裂，这为哺乳动物受精卵原核核膜破裂的调控阐明了具体机理。明确致病机理后，为探索该类卵裂障碍患者可能的治疗策略，本研究第三章中，应用了一种CHK1蛋白的抑制剂——PF477736来抑制CHK1突变蛋白增高的激酶活性，小鼠携带突变的受精卵应用PF477736处理后发育成囊胚并能产生健康后代，患者突变受精卵应用PF477736后同样可以获得优质且有发育潜能的囊胚，这为携带CHK1基因突变不孕患者的治疗提供了有效干预手段。 　　第一章CHK1突变导致患者卵裂障碍的致病机制 　　目的 　　通过辅助生殖技术所获得的胚胎有很大一部分比例阻滞在早期胚胎发育阶段，其中受精卵阶段发育阻滞被称为“卵裂障碍”。卵裂障碍患者经过多周期的体外助孕治疗均无法获得可移植胚胎，但其病因机制不清，本章研究旨在深入挖掘其遗传病因并解析具体致病机制。 　　方法 　　为了阐明卵裂障碍罕见患者的遗传病因，我们收集了2013年至2018年从我院行体外助孕的29例卵裂障碍患者（原核大都不消失）与其家系的外周血。首先，进行患者全外显子组测序，通过生信分析方法过滤和筛选可能的致病位点，将候选位点在300例正常对照女性中进行验证。其次，为明确最终筛选出的CHK1突变的致病性，通过小鼠受精卵显微注射过表达CHK1突变模拟患者卵裂障碍表型。为初步研究CHK1突变对蛋白功能的影响，我们利用同源建模构建了突变蛋白的结构模型并利用蛋白免疫荧光检测了其在细胞内的定位。再次，为深入研究CHK1突变导致患者卵裂障碍的机制，我们利用蛋白激酶活性检测技术检测了突变CHK1蛋白的活性，并通过蛋白免疫印迹检测了其下游细胞周期因子CDC25C与CDK1的磷酸化水平。最后，为验证CDC25C/CDK1通路在CHK1突变导致卵裂障碍中的重要作用，我们通过点突变技术将CDC25C与CDK1的关键磷酸化位点突变，而后与CHK1突变一起通过显微注射的方式在小鼠受精卵内过表达，观察其对受精卵分裂的影响。 　　结果 　　1.卵裂障碍患者CHK1致病突变的鉴定 　　我院病例系统记录了一个有三位不孕女性的较大家系，家系先证者在我院行三个周期的助孕治疗均无法获得可移植胚胎;当正常对照受精卵发育到8细胞阶段时，患者受精卵分裂受阻且大部分受精卵仍可见清晰原核;患者的姐姐和一个姑姑同样有相似不孕症病史，呈现常染色体显性遗传模式，我们随后对家系中的先证者与两个正常对照女性进行了全外显子组测序。经过严格的位点筛选与验证，最终定位到CHK1基因的一个突变(p.R379Q)。接下来，我们在另外26位表现为受精卵阻滞且伴明显原核的患者中又发现了另外了三个CHK1突变(p.F441fs*16,p.R442Q,p.R420K),并分别追踪到三个家系,其突变率在患者中可达到24％。这四个遗传或新发的CHK1突变在我院300例正常对照女性中均不存在，经软件(SIFT、Polyphen、MutationTaster)预测有害性高，ACMG评分均为可能致病，在公共数据库中未见报道，并且突变对应的氨基酸残基在各个物种间高度保守。 　　2.小鼠受精卵携带CHK1突变可模拟患者卵裂障碍 　　卵母细胞与植入前早期胚胎的免疫印迹和定量PCR等结果显示CHK1在人和小鼠的受精卵和2-细胞阶段高表达，提示其在受精卵阶段可能发挥重要作用。过表达突变型CHK1的小鼠受精卵卵裂率显著低于过表达野生型CHK1的受精卵，尤其以截短突变组最为显著;而且，当表达野生型CHK1的受精卵发育到2细胞阶段时，各突变组受精卵仍不分裂且可见清晰原核，这与携带CHK1突变患者的表型一致。 　　3.突变CHK1蛋白的结构与核质定位改变 　　CHK1突变蛋白同源建模显示，除外截短突变可导致明显的蛋白截短外，错义突变R379Q与R442Q改变了与周围氨基酸残基间的氢键连接;同时由于氨基酸性质的改变，突变还会影响蛋白表面电势。野生型CHK1蛋白以核内定位为主，突变型CHK1胞质定位信号增强，其中截短突变以胞质定位为主。CHK1的这四个致病突变位于CHK1C-端的保守基序内，并分别定位于其出核信号与核定位信号区。用出核转运抑制剂将出核信号抑制后发现，除外截短突变仍保持胞质定位外，其余各组错义突变均恢复核定位，表明这些突变定位的改变是由于出核信号或核定位信号的破坏，CHK1突变后核质定位的改变可能影响其生物学功能。 　　4.CHK1突变通过CDC25C/CDK1通路导致卵裂障碍 　　激酶活性检测显示突变各组CHK1激酶活性增加，酶活增高的突变CHK1可引起抑制性磷酸化的CDC25C和CDK1的表达增高;CDC25C与CDK1关键的磷酸化位点分别突变失活后突变受精卵的卵裂率明显升高。综上，CHK1蛋白突变后激酶活性活性升高，通过CDC25C/CDK1通路导致卵裂障碍。 　　结论 　　我们在四个独立家系中分别发现了四个CHK1基因的遗传或新发杂合致病突变，并且小鼠受精卵过表达CHK1突变可模拟患者卵裂障碍的表型。深入机制研究发现这四个CHK1突变改变了蛋白构象，影响CHK1在细胞内的定位，导致蛋白激酶活性增高并通过下游CDC25C/CDK1通路引起卵裂障碍。本章的研究为卵裂障碍型不孕症患者的诊断提供了新的分析靶标，并解析了具体致病机制。 　　第二章CHK1突变影响受精卵原核核膜破裂的机制 　　目的 　　哺乳动物受精卵原核核膜破裂是成功启动第一次有丝分裂的重要保证，但其调控机制仍不明确。携带CHK1突变的患者发育阻滞的受精卵还伴有明显的原核核膜不破裂现象，本章的研究旨在解析CHK1调控受精卵原核核膜破裂的具体分子机制。 　　方法 　　鉴于突变CHK1蛋白的胞质定位增强，为明确突变是否主要影响受精卵胞质内的生物学事件，我们首先利用前原核移植技术对患者突变的受精卵与正常供体受精卵进行核质互换，并观察患者核质互换后受精卵的发育情况。接下来，为研究CHK1突变影响的关键生物学过程或通路，我们收集患者捐科研的受精卵进行单细胞转录组测序分析。鉴于转录组测序结果提示患者受精卵细胞骨架成分改变，随后利用过表达突变的小鼠受精卵验证关键细胞骨架成分F-肌动蛋白对原核核膜破裂的调控作用。随后，为探索CHK1突变具体如何调控受精卵内F-肌动蛋白的解聚，我们通过免疫共沉淀、邻位连接、蛋白-蛋白分子对接等技术鉴定CHK1在受精卵内的互作底物并检测突变对底物互作的影响。而后，利用单分子荧光共振能量转移、过氧化氢产量检测、F-肌动蛋白解聚速率测定等技术检测了突变CHK1蛋白对其底物MICAL3的酶活影响。最后,为进一步验证MICAL3在介导CHK1调控原核核膜破裂过程中的重要作用，利用MICAL3的抑制剂处理突变受精卵观察卵裂情况与胚胎发育情况。 　　结果 　　1.患者突变受精卵胞质替换成正常胞质后可发育成囊胚 　　用正常受精卵胞质替换突变受精卵胞质后可使突变原核与正常胞质组成的重构受精卵成功发育到囊胚，而突变胞质与正常原核组成的重构受精卵则不能发育;且可将重构囊胚建成具有多能性、基因组倍性完整的胚胎干细胞系，提示突变对胞质影响更大。 　　2.突变CHK1蛋白可能通过促进F-肌动蛋白解聚而影响原核核膜破裂 　　患者受精卵单细胞转录组结果提示突变造成细胞骨架通路改变。鉴于小鼠受精卵过表达CHK1突变后核膜同样不破，与患者表型一致。我们随后通过小鼠受精卵显微注射观察突变受精卵F-肌动蛋白的表达，结果显示突变受精卵F-肌动蛋白的表达水平明显降低。抑制F-肌动蛋白和微管蛋白的组装均可使受精卵发育阻滞，但仅抑制F-肌动蛋白组装可阻碍受精卵原核核膜破裂，表明CHK1突变受精卵可能通过调控F-肌动蛋白的组装或解聚而影响原核核膜的破裂。 　　3.突变CHK1蛋白可改变与MICAL3的互作 　　通过体外受精收集6000颗小鼠受精卵进行免疫共沉淀与质谱检测鉴定到了CHK1的互作底物MICAL3,并且MICAL3主要定位在卵母细胞和HEK-293细胞的细胞质内。我们进一步通过细胞系免疫共沉淀、细胞系和人卵与胚胎的邻近连接等技术验证了CHK1与MICAL3间的互作。随后蛋白同源建模与单分子荧光共振能量转移实验证实,突变后CHK1的“自我抑制”构象破坏。进一步使用蛋白-蛋白分子对接、蛋白免疫共沉淀技术发现构象破坏的突变CHK1改变了与MICAL3之间的互作。 　　4.突变CHK1蛋白通过增加MICAL3酶活促进F-肌动蛋白解聚 　　MICAL家族属于单加氧酶，可介导肌动蛋白纤维氧化解聚，我们的结果显示突变CHK1蛋白可增强MICAL3活性，促进F-肌动蛋白解聚。此外，应用MICAL3抑制剂EGCG抑制MICAL3活性，可使突变受精卵恢复卵裂并发育至囊胚。 　　结论 　　将CHK1突变患者受精卵前原核转移入正常去核受精卵胞质后，可获得发育正常的囊胚，提示突变可能严重破坏了胞质内的生物学事件。深入研究表明CHK1突变通过破坏受精卵内F-肌动蛋白网络而影响原核核膜破裂过程。进一步研究发现CHK1可与受精卵内的MICAL3互作，并且构象改变的CHK1突变增加了MICAL3的活性，从而降低小鼠受精卵胞质内F-肌动蛋白的聚集网络。本章的研究为哺乳动物受精卵原核核膜破裂这一重要生物学过程的调控机制提供了理论依据。 　　第三章应用CHK1抑制剂探索卵裂障碍患者的干预策略 　　目的 　　卵裂障碍患者目前无有效的治疗方法，明确了其遗传病因与具体发病机制后，深入挖掘其潜在的治疗策略有望造福该类不孕症患者。本章的研究旨在探索卵裂障碍患者的干预措施，并验证其有效性与安全性。 　　方法 　　为了初步测试CHK1抑制剂PF477736是否可使携带CHK1突变的受精卵正常分裂，我们首先利用已报道的作用浓度处理突变小鼠受精卵并观察其卵裂情况;随后利用不同浓度的PF477736处理并观察突变受精卵的囊胚发育情况以测试最佳作用浓度，并通过胚胎移植技术检测抑制剂处理后的胚胎是否能发育成正常后代。为进一步检测抑制剂对患者受精卵的挽救效果，我们接下来首先利用患者在体外培养了三天但仍不分裂的受精卵测试PF477736的药效;而后进一步在患者新鲜受精卵体外培养的过程中加入PF477736观察其能否发育成囊胚;最后为测试抑制剂处理所获囊胚的发育潜能，我们将其构建成胚胎干细胞系并通过免疫荧光、全基因组拷贝数分析和基因型鉴定进行检测。 　　结果 　　1.CHK1抑制剂使携带突变的小鼠受精卵发育成囊胚并产生后代 　　鉴于突变CHK1酶活增高，我们尝试应用CHK1抑制剂PF477736进行挽救实验。与预期一致，PF477736可以降低突变CHK1下游CDC25C/CDK1磷酸化蛋白的水平。初步测试发现，PF477736可显著提高各突变受精卵的卵裂率。随后，利用过表达CHK1突变的小鼠受精卵探索到PF477736的最佳作用浓度(10nM),在该浓度下小鼠突变受精卵可发育成基因组倍性完整的囊胚，并产生健康后代。 　　2.CHK1抑制剂使患者受精卵发育成优质且有发育潜能的囊胚 　　患者体外发育阻滞而后冻存的的受精卵，解冻后应用PF477736处理可发生卵裂;随后我们对患者捐赠的新鲜受精卵应用PF477736处理，值得庆幸的是，患者捐赠的5颗受精卵中有2颗发育成优质囊胚，并且这些囊胚建成了基因组倍性完整且具有多能性的胚胎干细胞系，这为该类患者的精准治疗提供了有效方法。 　　结论 　　使用CHK1抑制剂有效地挽救了突变所致的小鼠和患者受精卵阻滞表型，并可产生具有良好发育潜能的囊胚。本章的研究为这种疾病的精准治疗提供了有效方法。