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摘要背景和目的:<br>　　慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)是严重危害人类健康的常见病和多发病，是全球第三大死因，随着人口老龄化，COPD将带来更大的经济和社会负担。吸烟是COPD的主要致病因素，香烟烟雾(Cigarette Smoke,CS)可刺激支气管上皮细胞发生氧化应激并损伤支气管上皮细胞，但其确切的发病机制仍不清楚。自噬是真核细胞中广泛存在、正常内稳态所必需的一种细胞过程，有研究发现自噬可影响氧化应激水平从而参与COPD的发生发展，但自噬对于COPD的影响机制争论不一。我们通过生物信息学研究发现自噬基因鞘氨醇激酶1(Sphingosine Kinase 1,SPHK1)在COPD患者肺组织中高表达，且有研究证实SPHK1参与COPD的发病，但SPHK1影响COPD发生发展的机制尚不清楚。我们通过蛋白相互作用网络分析发现SPHK1 可与 TNF 受体相关因子 2(TNF Receptor-associated Factor 2,TRAF2)作用，而TRAF2作为E3泛素连接酶可使自噬蛋白Beclin1的第63位赖氨酸发生泛素化修饰从而促进自噬，故我们推测SPHK1可能通过TRAF2调控支气管上皮细胞自噬影响氧化应激水平进而参与COPD的发生发展。本课题拟通过敲减和过表达SPHK1,探讨SPHK1在香烟烟雾提取物(Cigarette Smoke Extract,CSE)刺激后支气管上皮细胞自噬及氧化应激中的作用，并通过SPHK1及TRAF2小干扰共转染和质粒共转染探讨SPHK1通过TRAF2调控自噬水平的机制。最后在肺气肿小鼠模型和COPD患者外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mono-nuclear Cells,PBMC)中验证 SPHK1 的表达，检测自噬和氧化应激水平。上述研究有助于我们进一步明确SPHK1对自噬的调控作用及氧化应激水平的影响，寻找针对性的治疗靶点，为COPD的精准治疗提供新思路。<br>　　方法:<br>　　1. 从自噬数据库(HADb)获取自噬相关基因，从Gene Expression Omnibus(GEO)数据库获取COPD患者肺组织测序数据集GSE19407,利用R语言中limma包进行自噬基因差异表达分析。<br>　　2. 梯度浓度CSE处理BEAS-2B和16HBE细胞，运用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)及免疫印迹(Western Blotting)实验检测SPHK1分子及自噬蛋白表达水平。<br>　　3. 利用微管相关蛋白 1 轻链 3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3B)自噬双荧光慢病毒分别转染BEAS-2B和16HBE细胞构建稳转株后运用3％CSE刺激24小时，比较对照组支气管上皮细胞与CSE刺激组细胞的自噬水平，同时使用透射电镜观察自噬小体、自噬溶酶体的数量。<br>　　4. 利用小干扰RNA和质粒，在CSE刺激的BEAS-2B和16HBE细胞中分别敲低和过表达SPHK1，利用RT-qPCR和Western Blotting实验验证转染效率并检测自噬蛋白表达水平，透射电镜下观察自噬小体、自噬溶酶体。在LC3B自噬双荧光病毒稳转株中干预SPHK1的表达，荧光显微镜下观察自噬流。用活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)试剂盒检测氧化应激水平，并设置回复实验，分别加入自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)和自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,Rapa),分别检测自噬蛋白表达水平及氧化应激水平。<br>　　5.敲低和过表达CSE刺激下BEAS-2B和16HBE细胞中的SPHK1,运用RT-qPCR及Western Blotting实验验证效率并检测TRAF2的mRNA和蛋白表达水平。敲低和过表达TRAF2,Western Blotting实验验证效率并检测自噬蛋白水平。通过挽救实验同时干预TRAF2及SPHK1,Western Blotting检测自噬蛋白表达。<br>　　6. CS暴露联合鼻腔滴入脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)构建肺气肿小鼠模型，对小鼠肺组织切片进行苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色和免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色;检测不同组别小鼠肺组织的氧化应激水平，Western Blotting及RT-qPCR实验检测SPHK1及自噬相关分子表达。<br>　　7. 收集COPD患者及健康对照者外周血，提取PBMC,RT-qPCR及Western Blotting实验检测两组PBMC中SPHK1及自噬蛋白表达水平。<br>　　结果:<br>　　1. 生物信息学分析示SPHK1在COPD患者肺组织中较正常对照组高表达(P＜0.05)。随着CSE刺激浓度的升高，BEAS-2B和16HBE细胞中SPHK1分子表达升高，自噬水平减弱。<br>　　2. 荧光显微镜下观察3％CSE刺激24小时的LC3B自噬双荧光病毒转染的BEAS-2B和16HBE稳转株细胞示自噬流减弱;电镜结果表明3％CSE刺激后细胞自噬小体及自噬溶酶体减少。<br>　　3. 3％CSE刺激BEAS-2B及16HBE细胞24小时并敲低SPHK1后，LC3B Ⅱ/Ⅰ及Beclin1表达升高且P62表达降低，荧光显微镜观察到自噬流增强，电镜示自噬小体及自噬溶酶体增加;氧化应激水平检测示ROS和MDA降低，SOD升高，表明敲低SPHK1后CSE刺激下支气管上皮细胞自噬水平升高且氧化应激水平降低。过表达SPHK1后，LC3BⅡ/Ⅰ及Beclin1水平降低，P62升高，荧光显微镜示自噬流减弱，电镜示自噬小体及自噬溶酶体数量减少;氧化应激水平示ROS、MDA升高，SOD降低，表明过表达SPHK1后CSE刺激下支气管上皮细胞自噬水平降低且氧化应激水平升高。以上正反验证实验表明SPHK1调控CSE刺激下支气管上皮细胞自噬及氧化应激水平。<br>　　4. 3％CSE刺激BEAS-2B及16HBE细胞24小时并敲低SPHK1,且加入自噬抑制剂CQ后，Western Blotting检测示LC3B Ⅱ/Ⅰ增加，Beclin1降低且P62升高;氧化应激水平示ROS和MDA升高，SOD降低。3％CSE刺激BEAS-2B及16HBE细胞24小时并过表达SPHK1分子且加入自噬激活剂Rapa后，Western Blotting检测示LC3B Ⅱ/Ⅰ增加，Beclin1升高，P62降低;氧化应激水平示ROS和MDA降低，SOD升高。以上回复实验表明氧化应激水平变化依赖SPHK1对细胞自噬的调控。<br>　　5. 3％CSE刺激BEAS-2B及16HBE细胞24小时并敲低SPHK1后，RT-qPCR及Western Blotting检测示TRAF2分子表达水平升高，而过表达SPHK1之后，TRAF2分子表达水平降低，提示SPHK1调控TRAF2表达。敲低TRAF2后，自噬水平降低，而过表达TRAF2后自噬水平升高，提示TRAF2调控CSE刺激下支气管上皮细胞自噬。共转染SPHK1小干扰RNA和TRAF2小干扰RNA可逆转单独转染SPHK1时自噬水平的增加以及单独转染TRAF2小干扰时自噬水平的减弱，且共转染SPHK1和TRAF2质粒时同样可观察到此现象。表明SPHK1通过TRAF2调控支气管上皮细胞自噬。<br>　　6. CS暴露组小鼠肺组织切片HE染色证实肺气肿模型建立成功。IHC和Western Blotting及RT-qPCR检测显示肺气肿小鼠肺组织中SPHK1表达升高，自噬相关分子表达降低;且氧化应激指标MDA升高，SOD降低，提示肺气肿小鼠模型SPHK1高表达、自噬水平降低且氧化应激水平升高。<br>　　7. RT-qPCR 及 Western Blotting 检测示 COPD 患者 PBMC 中 SPHK1 表达升高,LC3B Ⅱ/Ⅰ及Beclin1均降低，提示COPD患者SPHK1高表达、自噬水平降低。<br>　　结论:<br>　　1. COPD患者肺组织中自噬相关基因SPHK1高表达。CSE刺激下支气管上皮细胞SPHK1同样高表达且自噬水平降低。<br>　　2. SPHK1加重CSE刺激引起的自噬受损及提高自噬介导的氧化应激水平。<br>　　3. SPHK1通过下调TRAF2导致CSE刺激的支气管上皮细胞自噬受损及氧化应激水平升高。<br>　　4.肺气肿小鼠肺组织及COPD患者PBMC中SPHK1高表达、自噬水平降低且氧化应激水平升高。